[发明专利]一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法及在葡萄糖检测中的应用

权利要求书

1.一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酶溶液配制：向反应容器中加入溶有次血红素短肽化合物与葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲液，放置于室温下；

(2)纳米花配制：向步骤(1)所得溶液中缓慢滴加CuSO₄水溶液，使得溶液中CuSO₄的终浓度为0.5-1mmol/L；

(3)自组装：15-45℃下静置36-108h；

(4)纳米花处理：离心5-10min，弃去上清液，留沉淀；

(5)依次加入超纯水、无水乙醇对沉淀进行清洗；

(6)将经步骤(5)处理所得沉淀置于反应容器中，水浴加热，至无水乙醇全部蒸发，即得产品。

2.根据权利要求1所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述次血红素短肽化合物包括：Dh-β-Ala-His-Glu；Dh-β-Ala-His-Lys；Dh-β-Ala-His-Asp；Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys。

3.根据权利要求1所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，次血红素短肽化合物的浓度为1mg/mL；葡萄糖氧化酶的浓度为1mg/mL；磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L，pH值为7.4。

4.根据权利要求1所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，CuSO₄水溶液的浓度为120mmol/L；溶液中CuSO₄的终浓度为0.8mmol/L。

5.根据权利要求1所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，具体步骤为：加入超纯水至反应容器的2/3体积，在超声波清洗器中超声1-3min，重复步骤(4)2-4次；然后加入无水乙醇至反应容器的1/3体积，在超声波清洗器中超声1-3min，重复步骤(4)1-2次；加入无水乙醇至反应容器的1/3体积，在超声波清洗器中超声5-8min，重复步骤(4)1-2次。

6.根据权利要求1所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，水浴温度为40-60℃。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的双酶共固定铜纳米花材料的制备方法制备得到的双酶共固定铜纳米花材料在葡萄糖检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)反应体系配制：将多个装有0.25mg共固定杂合纳米花的EP管中均加入800μL50mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液和100μL 10mmol/L TMB水溶液，然后再于上述不同的EP管中分别加入100μL 50mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液、100μL多种不同浓度的葡萄糖水溶液，使EP管中葡萄糖终浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1500μmol/L；加入完毕后涡旋10-30s使其充分混匀；

(2)纳米花催化级联反应的进行：将EP管静置于37℃水浴15min，使其充分反应；

(3)体系离心：将EP管置于离心机中以6000rpm的转速处理2min，使纳米花与体系溶液分离；再取上清液800μL用于紫外检测；

(4)紫外检测：在分光光度计652nm波长下，检测上清液的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值A_652nm为纵坐标，构建回归曲线，拟合回归方程，葡萄糖浓度与A_652nm成线性关系；

(5)利用纳米花检测未知浓度的葡萄糖：重复步骤(1)-(4)，将吸光度值A_652nm代入回归方程为纵坐标值，横坐标值即为葡萄糖浓度。