[发明专利]一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法及在葡萄糖检测中的应用

说明书

本发明提供了一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法及在葡萄糖检测中的应用，铜纳米花材料的制备方法包括以下步骤：(1)向反应容器中加入溶有次血红素短肽化合物与葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲液，放置于室温下；(2)缓慢滴加CuSO₄水溶液，使得溶液中CuSO₄的终浓度为0.5‑1mmol/L；(3)静置；(4)离心，弃上清液，留沉淀；(5)依次加入超纯水、无水乙醇对沉淀进行清洗；(6)沉淀置于反应容器中，水浴加热，至无水乙醇全部蒸发，即得；本发明制备得到的新型杂化纳米同时固定葡萄糖氧化酶与次血红素短肽化合物，实现葡萄糖检测双酶体系的构建，使得其既具有葡萄糖氧化酶的活性，又具有过氧化物酶的活性，从而实现葡萄糖的级联检测。

技术领域

本发明涉及葡萄糖检测技术领域，具体涉及一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法及在葡萄糖检测中的应用。

背景技术

作为生物分析中重要的研究领域，葡萄糖检测由于在生物学，临床医学，食品生产中具有重要应用价值，一直以来广受关注。

目前分析常用的基于葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的葡萄糖检测方法分为两个步骤：首先，葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化，葡萄糖氧化酶可以在氧气存在情况下，催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和H₂O₂。然后，前一步反应得到的H₂O₂在过氧化物酶催化下氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色的氧化型TMB多聚体(oxTMB)， oxTMB在652nm处具有最大光吸收值，可以通过分光光度法检测 oxTMB的浓度，进而计算出待侧样品中葡萄糖的浓度。

但由于这催化两个反应步骤的酶需要的最适温度和pH不同，现行的葡萄糖浓度检测需要进行多步操作，操作较为费时繁琐，且葡萄糖氧化产生的过氧化氢可能会在两步酶促反应过程中发生分解，影响检测的灵敏度，这制约了葡萄糖检测的进一步发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法及在葡萄糖检测中的应用，制备得到的新型杂化纳米同时固定葡萄糖氧化酶与次血红素短肽化合物，实现葡萄糖检测双酶体系的构建，使得其既具有葡萄糖氧化酶的活性，又具有过氧化物酶的活性，从而实现葡萄糖的级联检测。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种双酶共固定铜纳米花材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)酶溶液配制：向反应容器中加入溶有次血红素短肽化合物与葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲液，放置于室温下；

(2)纳米花配制：向步骤(1)所得溶液中缓慢滴加CuSO₄水溶液，使得溶液中CuSO₄的终浓度为0.5-1mmol/L；

(3)自组装：15-45℃下静置36-108h；

(4)纳米花处理：离心5-10min，弃去上清液，留沉淀；

(5)依次加入超纯水、无水乙醇对沉淀进行清洗；

(6)将经步骤(5)处理所得沉淀置于反应容器中，水浴加热，至无水乙醇全部蒸发，即得产品。

优选地，步骤(1)中，所述次血红素短肽化合物包括：Dh-β- Ala-His-Glu；Dh-β-Ala-His-Lys；Dh-β-Ala-His-Asp；Dh-β-Ala-His- Thr-Val-Glu-Lys。其中，Dh为次血红素，β-Ala为β-取代丙氨酸， His为组氨酸，Lys为赖氨酸，Glu为谷氨酸，Asp为天冬氨酸；Thr 为苏氨酸；Val为缬氨酸。

优选地，步骤(1)中，次血红素短肽化合物的浓度为1mg/mL；葡萄糖氧化酶的浓度为1mg/mL；磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L， pH值为7.4。