[发明专利]同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒和方法

说明书

本发明涉及一种同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒和方法，其中所述试剂盒包括以下试剂：(1)用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段的试剂；和(2)用于构建PacBio文库的试剂。

技术领域

本发明涉及一种利用PacBio长读长测序平台同时检测 HBA1/2和HBB基因突变的方法，以及适用于此方法的试剂盒。

背景技术

血红蛋白(Hemoglobin，简称Hb)是红细胞内运输氧的特殊蛋白质。成年人血红蛋白(Adult Hemoglobin，简称HbA)是由两对α-珠蛋白和两对β-珠蛋白组成的四聚体。α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足会导致珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血。由α-珠蛋白基因突变引起的α珠蛋白缺失或不足称为α- 地中海贫血(简称α-地贫)；由β-珠蛋白基因突变引起的β珠蛋白缺失或不足称为β-地中海贫血(简称β-地贫)。地贫是世界上最常见的单基因遗传病，属常染色体隐性遗传，主要分布在地中海沿岸和东南亚国家等。

人源α-珠蛋白(alpha-globin)基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’-zeta-pseudozeta-mu-psedudoalpha-1- alpha-2-alpha-1-theta-3’。其中只有HBA1(alpha-1)和HBA2 (alpha-2)两个基因在胚胎和成年人中具有编码珠蛋白的能力，其他均为假基因或预测基因，或只在胚胎发育早期翻译表达珠蛋白。HBA1和HBA2基因的编码区域完全相同，在5’非编码区 (UTR)和内含子区域有少量碱基的不同，主要的差别集中在 3’UTR。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型和非缺失型突变。目前已经发现约50种α-珠蛋白基因簇区域的缺失可导致α-珠蛋白表达的减低或缺失，其中最常见的三种缺失型是-α^3.7、-α^4.2和--^SEA。如图1所示，HBA1和HBA2基因区域和附近有两个约 4Kb的进化上高度同源区域，按照序列可分为X/Y/Z和 X₂/Y₂/Z₂。Z和Z₂区域相隔3.7Kb，两个区域之间的重组会导致α-珠蛋白基因缺失1个拷贝，产生-α^3.7缺失型突变。X和X₂区域相隔4.2Kb，两个区域之间的重组也会导致α-珠蛋白基因缺失 1个拷贝，产生-α^4.2缺失型突变。而--^SEA缺失区域超过19Kb，包含α-珠蛋白基因簇中HBA1和HBA2在内的多个基因。目前全球已报道至少70种导致点α-珠蛋白表达降低或缺失的点突变，其中在中国最常见的三种点突变类型是位于HBA2基因上的QS、CS和WS。

人源β-珠蛋白(beta-globin)基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5’-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta -3’。其中只有HBB(beta)基因在成年人中编码珠蛋白，其他四个基因均在胚胎发育过程中表达，或者在成年人中表达量非常低。HBB基因的突变主要是非缺失型突变，包括单点突变，小的插入和缺失等。目前全球已经有超过300种HBB基因的突变被报道，但是其中会引起90％人群的β-珠蛋白表达缺失或减少的常见突变为40种左右。引起β-珠蛋白表达减少的突变主要集中在HBB基因区域，通过影响转录、RNA加工、mRNA剪接和翻译等来降低β-珠蛋白的表达。在中国，最主要的17种突变占HBB 基因致病性突变的95％以上，包括-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、 -28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、 CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、 CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T， G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。