[发明专利]一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法

权利要求书

1.一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法，包括如下步骤：

(1)将烤烟烟叶样品和/或其破碎物与水相混合，得到第一混合物；其中，所述混合依次在超声条件和振摇条件下进行；

(2)将第一混合物离心分离，得到沉淀物和上清液；其中，离心转速为5000～14000rpm，离心时间为0.5～10分钟；

(3)将沉淀物和上清液以1:(0.2～10)(mg/mL)的比例相混合，得到第二混合物；

(4)将第二混合物涂在培养基表面，在20℃～40℃培养1～8天，得到混合菌落；其中，所述培养基包含细菌抑制剂和PDA培养基；

(5)对混合菌落进行划线分离，得到单菌落。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，超声条件包括如下(A)至(D)中的一项或多项：

(A)超声频率为20～80kHz；

(B)超声温度为25℃～60℃；

(C)超声的功率密度为0.01～0.05w/mL；

(D)超声时间为2～20分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，振摇条件包括如下(a)至(c)中的一项或多项：

(a)振摇速率为100～200r/m；

(b)振摇时间为0.5～5小时；

(c)通过摇床进行振摇。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，烤烟烟叶样品和/或其破碎物与水的重量比为1:(10～40)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，所述上清液为中部和/或下部的上清液。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，通过移液枪反复吹吸进行混合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，第二混合物的涂布量为100～500μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其还包括如下步骤：

(6)通过ITS鉴定法和/或菌落特征确定单菌落的名称，或者通过系统发育法确定单菌落的名称。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(6)中，所述菌落特征选自菌落形状、菌落颜色、菌落表面状态、菌落隆起程度、菌落边缘、孢子颜色、菌丝结构、孢子结构和产孢结构中的至少一种。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于如下1)至10)中的一项或多项：

1)分离的真菌≥2种，优选为≥3种；

2)分离的真菌为选自Acremonium persicinum、Aspergillus amstelodami、Aspergillus hiratsukae、Aspergillus intermedium、Aspergillus pseudoglaucus、Aspergillus ruber、Aspergillus sydowii、Cladosporium cladosporioides、Cladosporium halotolerans、Eutypella sp.ZZ2、Fusarium chlamydosporum、Hypoxyloninvestiens、Hypoxylon monticulosum、Lichtheimia ramosa、Myrmecridium schulzeri、Neosartorya fischeri、Neurospora intermedia和Nigrospora oryzae中的多种；

3)所述烤烟烟叶的产地选自四川凉山会理、贵州遵义铜仁、福建连城、云南保山隆阳、福建三明尤溪和山东临沂中的至少一个；

4)所述烤烟烟叶的等级选自B3F、B2F、C4F、C2F、B3F和C4X2F中的至少一个；

5)所述烤烟烟叶为经存储的烤烟烟叶；

优选地，存储时间为0.5～10年；

优选地，存储的平均温度为15℃～35℃；

优选地，存储的相对湿度为40％～70％；

6)步骤(1)中，所述烤烟烟叶样品通过五点取样法获得；

7)步骤(1)中，在超声条件和振摇条件之前，所述混合还在人工摇动条件下进行；

8)步骤(2)中，采用离心管作容器进行离心分离；

优选地，离心管的容积为20～80mL；

9)步骤(4)中，所述细菌抑制剂为青链霉素混合液；

10)步骤(4)中，所述培养基中细菌抑制剂的重量百分含量为0.2％～4％。