[发明专利]一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法

说明书

本发明属于微生物或烟草领域，具体涉及一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法，包括如下步骤：(1)将烤烟烟叶样品和/或其破碎物与水相混合，得到第一混合物；其中，混合依次在超声条件和振摇条件下进行；(2)将第一混合物离心分离，得到沉淀物和上清液；其中，离心转速为5000～14000rpm，离心时间为0.5～10分钟；(3)将沉淀物和上清液以1:(0.2～10)(mg/mL)的比例相混合，得到第二混合物；(4)将第二混合物涂在培养基表面，在20℃～40℃培养1～8天，得到混合菌落；其中，培养基包含细菌抑制剂和PDA培养基；(5)对混合菌落进行划线分离，得到单菌落。本发明方法能从烤烟烟叶有效分离出多种真菌。

技术领域

本发明属于微生物或烟草领域，具体涉及一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法。

背景技术

通常，植物中微生物的分离方法包括浇注平板法和涂布平板法。浇注平板法又称稀释倒平板法，是将植物组织与无菌水制作的菌液做一系列稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化的培养基混合，倾入灭过菌的培养皿中，待培养基凝固后，制成含菌的平板，保温培养一定时间可得到菌落；浇筑平板法比较适合分离兼性厌氧的细菌和酵母菌。涂布平板法是将植物组织与无菌水制作的菌液做一系列稀释，然后取不同稀释液少许分别滴加在提前制好的无菌培养基表面，用无菌玻璃棒涂布，使菌液均匀分散在培养基表面，倒置温箱培养后得到菌落；涂布平板法适用于分离好氧性或有气生菌丝的放线菌和细菌及产孢较多的真菌。而且，植物组织与无菌水混合制作菌液的过程一般在振摇条件下进行。

不同于一般的植物，烤烟烟叶是由采收的烤烟新鲜烟叶经高温初烤、高温高压复烤加工及一段时间仓储后得到的，经加工和仓储处理的烤烟烟叶结构已不同于新鲜烟叶；并且，在采收、运输、加工及仓储中，烤烟烟叶容易沾染真菌孢子，由于烟叶本身可提供真菌繁殖所需的营养物质，因此，烤烟烟叶易发生霉变。为了研究抗霉方法或筛选有效的抗霉剂，需对烤烟烟叶中的真菌多样性进行研究，因此，需分离出烤烟烟叶中的多种真菌。

但是，研究发现，常见的植物微生物分离方法无法有效分离出烤烟烟叶中的多种真菌或者仅能分离出烤烟烟叶中极少种类的真菌。

目前亟需一种能从烤烟烟叶中有效分离多种真菌的方法。

发明内容

本发明提供了一种从烤烟烟叶中分离真菌的方法，该方法能从烤烟烟叶中有效分离出多种真菌，获得多种真菌纯菌种。

本发明涉及一种从烤烟烟叶中分离(多种)真菌的方法，包括如下步骤：

(1)将烤烟烟叶样品和/或其破碎物与(无菌)水相混合，得到第一混合物；其中，所述混合依次在超声条件和振摇条件下进行；

(2)将第一混合物离心分离，得到沉淀物和上清液；其中，离心转速为5000～14000rpm(例如6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000rpm)，离心时间为0.5～10分钟(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9分钟)；

(3)将沉淀物和上清液以1:(0.2～10)(mg/mL)的比例(例如1:0.3(mg/mL)、1:0.4(mg/mL)、1:0.5(mg/mL)、1:0.6(mg/mL)、1:1(mg/mL)、1:2(mg/mL)、1:3(mg/mL)、1:4(mg/mL)、1:5(mg/mL)、1:6(mg/mL)、1:7(mg/mL)、1:8(mg/mL)、1:9(mg/mL))相混合，得到第二混合物；

(4)将第二混合物涂在(灭菌)培养基表面，在20℃～40℃(例如25℃、30℃、35℃、38℃)培养1～8天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天)，得到混合菌落；其中，所述培养基包含细菌抑制剂和PDA培养基；

(5)对混合菌落进行划线分离，得到单菌落。

本发明一些实施方式中，步骤(1)中，所述烤烟烟叶样品破碎物通过(灭菌)剪刀剪碎烤烟烟叶样品而获得。