[发明专利]DNA甲基化检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒含有半靶向引物和通用引物，其中，所述半靶向引物与感兴趣DNA的5’端序列结合，所述通用引物不与该感兴趣DNA序列结合，而与该感兴趣DNA序列的3’末端所连接的含唯一分子标签和通用末端的接头结合；优选地，所述感兴趣DNA为血浆游离DNA。

2.如权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒还含有进行PCR所需的试剂，包括扩增缓冲液、4种dNTP和DNA聚合酶。

3.如权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述半靶向引物的部分序列与感兴趣DNA的5’端的序列互补；所述通用引物与接头中的所述通用末端互补。

4.一种DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，所述建库试剂盒包括：

(1)用于连接到感兴趣DNA的3’末端的接头，该接头含有唯一分子标签和通用末端；

(2)半靶向引物和通用引物，其中，所述半靶向引物与该感兴趣DNA的5’端序列结合，所述通用引物不与该感兴趣DNA序列结合，而与所述接头结合；和

(3)含有特异索引序列的引物。

5.如权利要求4所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，

所述半靶向引物的部分序列与感兴趣DNA的5’端的序列互补，另一部分序列与含有特异索引序列的引物的部分序列互补；

所述通用引物与接头中的所述通用末端互补；和

所述含特异索引序列的引物还含有与测序芯片上的寡聚序列结合的序列和与半靶向引物的部分序列互补的序列。

6.如权利要求4或5所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

DNA提取试剂，

DNA甲基化转化试剂，优选为亚硫酸氢盐转化试剂；

用于将接头连接到感兴趣DNA上的试剂，优选包括连接酶，选自5’App DNA/RNA连接酶、T4RNA连接酶、T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶和其组合；

PCR所需的试剂，优选包括扩增缓冲液、4种dNTP和DNA聚合酶；以及

DNA纯化试剂。

7.一种构建DNA甲基化文库的方法，其特征在于，所述方法包括以经甲基化转化并连接上接头的感兴趣DNA序列为模板，使用半靶向引物和通用引物进行扩增的步骤，其中，所述半靶向引物与该感兴趣DNA序列的5’端序列结合，所述通用引物不与该感兴趣DNA序列结合，而与所述接头结合；优选地，所述方法还包括甲基化转化、接头连接和索引序列扩增的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1：对感兴趣的DNA序列进行甲基化转化处理；

S2：给经甲基化转化处理的DNA序列连接上带有唯一分子标签和通用末端的接头；

S3：以S2的产物为模板，使用所述半靶向引物和通用引物进行PCR扩增；和

S4：以S3得到的PCR产物为模板，用带有特异索引序列的引物进行PCR扩增，得到最终的DNA甲基化文库。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-6中任一项所述的试剂盒实施。

10.一种DNA测序方法，所述方法包括采用权利要求7-9中任一项所述的方法构建DNA甲基化文库，然后进行测序。