[发明专利]DNA甲基化检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及DNA甲基化文库构建及检测试剂盒，并涉及相应的检测方法。本发明利用半靶向引物和通用引物进行对经甲基化转化处理并连接了接头的感兴趣DNA进行扩增。本发明的方法特别适用于血浆游离DNA的扩增。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及DNA甲基化检测试剂盒及检测方法。

背景技术

通常，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后可设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。或者，可设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。

血浆游离DNA(cfDNA)是从血浆中分离出的短片段DNA，包括由坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到血液中的血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)。cfDNA以核小体微单位，以单个、双联或者三联的形式进入血液，片段长度主要在166bp左右(即缠绕在每个组蛋白上面的DNA的长度)，并逐步分解，通常半衰期只有2个小时。

一般10ml外周血中cfDNA含量约在32ng(Newman等，2016。ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％计算，只有约300pg，即大约45个细胞裂解的DNA量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctDNA的含量可能相当于5000个细胞中只有1～2个细胞是肿瘤细胞，所以对检测方法的敏感性要求非常高。

近年来，基于ctDNA的液体活检技术迅速发展，通过二代测序技术，检测血浆游离DNA中的甲基化、突变、融合等信息，为肿瘤筛查、伴随诊断和治疗指导提供了重要作用。

但现有的检测ctDNA的方法所需的起始量ctDNA较高，而且由于游离DNA存在随机片段化的问题，传统建库方法往往难以高效捕捉想要检测的基因区域。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中存在的不足，提供DNA，尤其是适用于低起始量血浆游离DNA的甲基化检测试剂盒及检测方法。

因此，本发明提供一种PCR试剂盒，所述PCR试剂盒含有半靶向引物和通用引物，其中，所述半靶向引物与感兴趣DNA的5’端序列结合，所述通用引物不与该感兴趣DNA序列结合，而与该感兴趣DNA序列的3’末端所连接的含唯一分子标签和通用末端的接头结合。

在一个或多个实施方案中，所述PCR试剂盒还含有进行PCR所需的试剂，包括扩增缓冲液、4种dNTP和DNA聚合酶。

在一个或多个实施方案中，所述半靶向引物的部分序列与感兴趣DNA的5’端的序列互补；所述通用引物与接头中的所述通用末端互补。

在一个或多个实施方案中，所述感兴趣DNA为血浆游离DNA。

本发明还提供一种DNA甲基化文库建库试剂盒，所述建库试剂盒包括：

(1)用于连接到感兴趣DNA的3’末端的接头，该接头含有唯一分子标签和通用末端；

(2)半靶向引物和通用引物，其中，所述半靶向引物与该感兴趣DNA的5’端序列结合，所述通用引物不与该感兴趣DNA序列结合，而与所述接头结合；和

(3)含有特异索引序列的引物。

在一个或多个实施方案中，所述半靶向引物的部分序列与感兴趣DNA的5’端的序列互补，另一部分序列与含有特异索引序列的引物的部分序列互补。

在一个或多个实施方案中，所述通用引物与接头中的所述通用末端互补。