[发明专利]模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法

权利要求书

1.一种模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)仿生分子印迹阵列膜的制备

通过优化实验，优选功能单体、交联剂、致孔剂这些分子印迹制备要素，以表面接枝法制备分子印迹阵列膜；

(2)SERS增强基底Au NPs@MIL-101的制备

MIL-101的合成方法：在乙酸钠水溶液中加入九水硝酸铬和1,4-苯二甲酸，将混合物加入水热高压釜中进行反应，自然冷却后，首先使用砂漏斗过滤混合物，去除未反应物质，而且清洗MIL-101产物，然后将MIL-101在真空干燥箱中干燥；

Au NPs@MIL-101的合成过程：采用原位还原法制备Au NPs@MIL-101增强基底；

(3)Pt NPs@BSA-半抗原探针的制备

1)牛血清白蛋白-半抗原(BSA-半抗原)偶联物的合成

BSA-半抗原偶联物由BSA的氨基和半抗原化合物的羧基之间通过碳二亚胺法合成，具体步骤如下：

A.将三唑磷半抗原和N-羟基琥珀酸盐(NHS)溶解在二甲基甲酰胺溶液(DMF)中，并搅拌一段时间，得到溶液a，

B.将N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解在DMF中，并将DCC逐滴加入a中，得到溶液b，

C.将溶液b室温下避光搅拌过夜，通过上述步骤，半抗原化合物的羧基被活化，将溶液b离心，得到活化的半抗原上清液；

D.将BSA溶解到碳酸盐缓冲溶液中；

E.将上述活化半抗原上清液逐滴加到BSA溶液中，并在室温下搅拌，最终获得BSA-半抗原缀合物；

F.最后，将BSA-半抗原偶联物溶液用PBS缓冲溶液透析3天以除去未结合的半抗原，纯化后，将BSA-半抗原偶联溶液与相同体积的甘油混合，在-20℃保存备用；

2)Pt NPs的合成

用柠檬酸钠还原法制备Pt NPs，首先将柠檬酸钠水溶液加入到氯铂酸溶液中，在搅拌下加热至沸腾，在一段时间内，颜色由浅黄色变为黑色，停止加热后继续搅拌，冷却至室温；

3)Pt NPs@BSA-半抗原探针的制备

首先用碳酸钾调节Pt NPs溶液的pH值，然后将不同体积的BSA-半抗原溶液加入到PtNPs溶液中，静置12h后，离心，并将沉淀物用PBS缓冲溶液溶解，以除去未结合的BSA-半抗原，然后，将浓缩的Pt@BSA-半抗原探针重新悬浮于200μL含有1％PEG 20000的PBS缓冲溶液中，在4℃下保存待用；

(4)检测过程

首先用含有吐温20的PBS缓冲溶液洗涤仿生分子印迹96孔阵列板三次，除去杂质，具体反应检测过程如下：

①用工作缓冲溶液稀释三唑磷标准品溶液及探针溶液，并各取适当体积加入到仿生阵列板的微孔中，在室温下反应一段时间；

②用PBST洗涤仿生阵列板三次除去未结合的农药分子和模拟酶探针；

③然后，将ELISA底物TMB加入到微孔中并在室温下反应，然后向每个孔中加入H₂SO₄终止液终止反应；

④最后，通过Lab Systems96孔板读数器记录在450nm处的吸光度值；

⑤SERS测定TMB²⁺溶液时，不加入H₂SO₄终止液，首先，将TMB²⁺溶液与Au NPs@MIL-101增强基底混合，并孵育反应，然后通过便携式拉曼光谱仪测量SERS“指纹”信息。