[发明专利]模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法

说明书

本发明涉及一种模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法，针对部分农药拉曼特征峰较弱其信号难以增强的技术问题，以及解决生物酶因受环境干扰大，储存条件要求高而限制分子印迹作为识别元件的适用范围的难题，以分子印迹阵列膜为识别元件，集成模拟酶复合探针信号放大和Au NPs@MIL‑101增强基底，创建了针对小分子检测的模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法。本发明是一种新的检测方法，快速简便，易于操作，不仅原料用量少、均一且方便快捷。

技术领域

本发明涉及检测方法领域，具体而言，涉及一种模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法。

背景技术

近年来，研究者们提出用间接SERS检测方法进行靶标物的测定以解决部分靶标物SERS信号弱的难题，间接检测过程中有两个必要条件：①SERS报告分子；②识别元件。分子印迹聚合物被誉为“人工抗体”，作为识别元件在传感器领域已得到广泛应用，如比色法、荧光、化学发光、电化学及表面等离子体共振等。酶联免疫吸附测定(ELISA)是各种样品中高灵敏度定性和定量检测分析物的常用检测方法。随着MIPs作为仿生抗体在ELISA方法进行小分子检测的应用，仿生酶联免疫吸附测定(BELISA)应运而生。

BELISA方法中的HRP标记探针对温度及pH条件要求较高，然而MIPs具有很多区别于抗体的性质，如pH，热和化学稳定性，因此，HRP和MIPs之间的联合应用会限制MIPs作为仿生抗体的适用性。近年来由于纳米酶优良特性，如制备简单，对我温度和pH具有耐受性，易于表面改性和低成本等，对其的需求及应用已不断增加。综上，我们提出了一种竞争性模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法(BNLISA)。纳米铂粒子(PtNPs)因其具有过氧化物酶活性，并且合成简单、方便储存、易于被核酸和蛋白质进行表面修饰等优点而广泛应用于模拟酶检测方法研究中。在实验中，检测靶标的结构类似物(半抗原)需要引入以便与靶标形成竞争体系。牛血清白蛋白(BSA)因具有丰富的官能团，如氨基、羧基、硫醇和二硫化物，既能与其他分子通过化学键相连接也能通过硫醇键和静电作用与PtNPs相作用，因此选择BSA作为“连接桥”以连接模拟酶PtNPs信号放大探针及靶标结构类似物-半抗原，最终形成模拟酶信号放大复合探针而代替生物酶探针，此复合探针既能起到竞争识别作用又能催化TMB转化为TMB²⁺，达到比色及SERS双重检测。

原位聚合法制备分子印迹聚合物阵列膜不仅需要大量的模板分子及化学试剂，对环境不友好，而且当通过超声波方法去除模板时，印迹膜容易脱落，导致孔与孔之间的印迹膜不均匀。为解决上述问题，我们提出通过沉淀聚合得到均匀的MIPs微球，利用离子液体(IL)通过“接枝”法制备分子印迹聚合物阵列膜，不仅原料用量少、均一且方便快捷。

金纳米颗粒(AuNPs)具有很好的SERS活性，并已成功用作SERS基底，MIL-101是一种高度多孔且热稳定好的金属有机骨架，可增强AuNPs的稳定性，改善SERS信，因此我们通过原位还原法合成了AuNPs@MIL-101作为SERS增强底物。

发明内容

本发明针对部分农药拉曼特征峰较弱其信号难以增强的技术问题，以及解决生物酶因受环境干扰大，储存条件要求高而限制分子印迹作为识别元件的适用范围的难题，以分子印迹阵列膜为识别元件，集成模拟酶复合探针信号放大和Au NPs@MIL-101增强基底，创建了针对小分子检测的模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种模拟酶仿生免疫比色/SERS快速检测方法，包括以下步骤：

(1)仿生分子印迹阵列膜的制备

通过优化实验，优选功能单体、交联剂、致孔剂这些分子印迹制备要素，以表面接枝法制备分子印迹阵列膜；

(2)SERS增强基底Au NPs@MIL-101的制备