[发明专利]一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB-Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB-Cap构建rB-Cap重组杆粒，将SF9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50%以上时，使用双无Grace昆虫细胞培养基替换原有培养基，取8 μL Cellfectin^®Ⅱ转染试剂加入到100 μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀，将3 μg所述重组杆粒rB-Cap加入到100 μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；将稀释的重组杆粒rB-Cap加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20 min，将混合物均匀的滴加到6孔板中，4h后弃掉转染混合物，换为添加有青霉素、链霉素、10%（V:V）FBS的SF900^®Ⅱ完全培养基，27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象，待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，4000 r/min，4℃离心5min去掉上清中的大分子物质，使用0.22 μm低蛋白结合滤器过滤，滤出液，所述滤出液含表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒感染High Five细胞48h，3 500 r/min，4℃离心20 min，取上清，0.45μm低蛋白结合滤器过滤，20%（M:V）蔗糖垫35 000 r/min，4℃离心2 h，使用2 mL PBS重悬沉淀，进行40-60-80%（M:V）蔗糖密度梯度离心，缓慢取出60-80%蔗糖层之间的乳白色环状部分，使用PBS稀释至40 mL，35 000 r/min，4℃离心2 h，去掉蔗糖，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP；其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组穿梭质粒pFB-Cap是将猪圆环病毒Ⅲ型的Cap蛋白基因插入到pFastBac 1载体形成的；所述rB-Cap重组杆粒是将所述的pFB-Cap重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞发生转座所得。

2.如权利要求1所述的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，其特征在于，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列的扩增正向引物PCV3F序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物PCV3R序列如SEQ IDNO.4所示。