[发明专利]一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法

说明书

本发明实施例公开了一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB‑Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB‑Cap构建rB‑Cap重组杆粒，将所述rB‑Cap重组杆粒转染SF9细胞，得到表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap基因的重组杆状病毒rBV‑PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒rBV‑PCV3 Cap感染High Five细胞，纯化，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP过程；其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实施例基于杆状病毒‑昆虫细胞表达系统，使用无血清悬浮培养的High Five细胞表达制备，结合蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心纯化获得PCV3病毒样颗粒。本发明实施例的病毒样颗粒免疫原性好，安全性高，具有良好的开发与应用前景。

技术领域

本发明实施例涉及生物制药技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒的制备方法。

背景技术

临床上，猪圆环病毒Ⅲ型(porcine circovirus 3，PCV3)感染的猪多会出现腹下黑斑、产死胎或木乃伊肽，但种猪采食量和精神状态良好；保育猪多发生混合感染，精神状态极差、高烧扎堆、腹式呼吸等，发病严重的猪场死亡率超过15％，已给养殖业带来了一定的经济损失。

PCV3是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒离子直径约17-20nm，无囊膜。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，而Cap蛋白是PCV诱导动物机体产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此PCV2疫苗对于PCV3所能提供的保护非常有限。PCV3作为一种新型病毒，该病毒的病原学研究尚不明确，国内外尚未有分离纯化PCV3的报道，因此制约了利用灭活疫苗进行防控的思路。

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一类由病毒的部分或全部结构蛋白自动组装成的具有与天然病毒结构基本一致的空心蛋白颗粒，不具有病毒的遗传物质，不能自主复制，作用于机体后能够引起机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其具有良好的免疫原性、较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。

根据VLPs的理化特性及用途通常可采用大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等原核表达系统，或酵母表达系统及哺乳动物细胞表达系统(如CHO、HEK293)等真核细胞表达系统进行制备。

综上所述，目前尚未通过上述表达系统制备出猪圆环病毒PCV3的病毒样颗粒，亟待研发一种能够高效、安全、低成本地制备猪圆环病毒PCV3的病毒样颗粒的方法。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法，以解决现有技术制备的病毒样颗粒免疫原性差以及不适合大规模生产的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB-Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB-Cap构建rB-Cap重组杆粒，将所述rB-Cap重组杆粒转染SF9细胞，得到表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap感染HighFive细胞，纯化，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP过程；

其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因核苷酸序列，在所述核苷酸序列起始密码子ATG前设有EcoRⅠ酶切位点序列，ATG后设有His标签序列，终止密码子后设有NotⅠ酶切位点序列。

优选的，所述病毒样颗粒的纯化采用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心法。