[发明专利]PCR预混液

说明书

本发明公开了一种PCR预混液，包括以下终浓度的组分：MgClsubgt;2/subgt;2～5mM，KCl 50～100mM，pH为8.3的Tris‑HCl 10～30mM，BSA 0.8～4mg/ml，dNTP 150～250nM，热启动Taq酶0.05～0.2u/ul，体积分数为0.25～1％的甘油，体积分数为0.5～1％的PEG20000，体积分数为0.5～1％的PEG5000，体积分数为0.1～0.5％的PEG‑PPG‑PEG，鱼精DNA 0.5～5ng/ul，甜菜碱0.3～2.5M，体积分数为1.5～3％的DMSO。本发明具有微滴均一性好，热稳定性好，扩增准确，Taq酶活性保持好的有益效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种PCR预混液。

背景技术

基于数字微滴的基因测序与分子检测技术，越来越广泛的应用于临床疾病的早期诊断及精准靶向治疗。其中以微滴式数字PCR为代表的基因检测技术近年来逐渐受到重视。相对传统的定量PCR技术，数字PCR技术具有灵敏度高、特异性强、样本量少、成本低等特点，是一种高灵敏度核酸检测和定量方法。

微滴式数字PCR系统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术，将每个样品生成数万个均一的纳升级微滴，目的片段和背景序列在微滴中随机分布，每个微滴都是一个独立的PCR反应器，完成PCR扩增后，微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。其中，微滴的均一性、热稳定性、生物相容性等以及高稳定的PCR扩增试剂是保证检测灵敏度和特异性的关键。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种PCR预混液，形成的微滴均一性好，热稳定性好，扩增准确，Taq酶活性保持好，本发明的预混液适用于探针法，为数字PCR仪器提供基础通用型试剂。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种PCR预混液，包括以下终浓度的组分：MgCl₂ 2～5mM，KCl 50～100mM，pH为8.3的Tris-HCl 10～30mM，BSA 0.8～4mg/ml，dNTP 150～250nM，热启动Taq酶0.05～0.2u/ul，体积分数为0.25～1％的甘油，体积分数为0.5～1％的PEG20000，体积分数为0.5～1％的PEG5000，体积分数为0.1～0.5％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 0.5～5ng/ul，甜菜碱0.3～2.5M，体积分数为1.5～3％的DMSO，其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。

优选的是，还包括：ω-3脂肪酸0.2ng/ul，大豆甾醇A 0.1ng/ul。

优选的是，还包括ω-3脂肪酸和大豆甾醇A的加入方法，具体为：将MgCl₂，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液后，置于0～10℃的环境中，静置30min，加入ω-3脂肪酸，第一次超声处理，混合均匀，然后再置于35℃环境中，静置30min，加入大豆甾醇，第二次超声处理，混合均匀，即得所述PCR预混液。

优选的是，第一次超声处理的频率为80kHz，超声时间30min，超声温度为10℃，第二次超声处理的频率为40kHz，超声时间20min超声温度为35℃。

优选的是，还包括：ω-6脂肪酸0.1ng/ul。

优选的是，还包括ω-6脂肪酸的加入方法，具体为：ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸一同加入混合液中。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明为预混试剂形式，微滴PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、探针、灭菌ddH₂O便可进行微滴PCR反应，操作简单方便。