[发明专利]水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法

权利要求书

1.一组试剂在提取水稻根表铁膜微生物DNA中的应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）野外采集水稻根部样品，去除根际土后，放入容器中，冰上保存运回实验室；

（2）加入去离子水浸没水稻根部，震荡培养，然后倒掉去离子水，重复该操作若干次，直至水稻根部表面土壤被去除干净；

（3）加入清洗液，震荡，然后倒掉清洗液，重复该操作若干次，去除铁膜表面吸附的金属离子；

（4）加入溶解液，放入55~60^oC水浴几个小时，该步用于溶解根表铁膜；然后将该溶解液用滤膜过滤，以去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物；

步骤（4）所述的滤膜为混合纤维素滤膜或玻璃纤维素膜，其孔径为0.22µm；

（5）取滤膜，加入液氮，研磨至滤膜破碎为止，加入直径为0.7 mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，震荡5~10分钟；再加入溶菌酶，35~37^oC水浴0.5~1.0小时；然后再加入蛋白酶K和SDS，35~40^oC摇床震荡0.5~1.0小时，后放入60~65^oC水浴锅中水浴1~2个小时；

步骤（5）中，滤膜与两种石榴石的重量比为1:1: 1；

（6）水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；

（7）加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，加入洗涤液和抽吸滤过的操作重复若干次；

（8）用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的DNA；

所述的试剂包括清洗液、溶解液、裂解液、洗涤液和洗脱液；

所述的清洗液含有10~15mM Tris、1~2mM EDTA，pH值为7~8；

所述的溶解液含有20~30mM柠檬酸三钠、100~150mM碳酸氢钠和50~100mM连二亚硫酸钠，pH值7~8；

所述的裂解液含有100~200mM NaCl、100~200mM Tris、1~2mM柠檬酸钠、10~20mM CaCl₂和50~100mM EDTA，pH值7~8；

所述的洗涤液含有50~100mM NaCl和10~20mM Tris，pH值7~8；

所述的洗脱液是含有5~10 mM Tris的去离子水，pH值7~8。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（6）所述离心的具体参数是，4~8^oC，10000~12000转/分钟，离心15~20分钟。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（6）所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为 25:24:1。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（8）所述的乙醇溶液，其体积百分比为70~75%。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（8）所述离心的具体参数是，4~8^oC，10000~12000转/分钟，离心2~10分钟。