[发明专利]水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法

说明书

本发明公开了一种水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法，该试剂包括清洗液、溶解液、裂解液、洗涤液和洗脱液；清洗液含有Tris和EDTA；溶解液含有柠檬酸三钠、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠；裂解液含有NaCl、Tris、柠檬酸钠、CaCl₂和EDTA；洗涤液含有NaCl和Tris；洗脱液是去离子水。目前仍未有针对水稻根际铁膜微生物DNA的提取方法，利用本发明提供的方法提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。提取出的DNA可达到对16S rRNA和aioA等基因的定量及高通量测序要求。

技术领域

本发明属于基因组提取领域，涉及一种水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法。

背景技术

水稻的茎和根系具有发达的通气组织，可将叶片光合作用制造的氧气及从外部环境中摄入的氧气输送到根部，以供处于厌氧条件下的根系进行呼吸。同时，向根系输送的氧气会有一部分渗出根的皮层细胞向根际环境扩散，在植物根际周围形成微氧区域，使植物根系处于相对氧化的状态。厌氧土壤中二价铁离子(Fe²⁺)被水稻根系分泌的氧气和氧化性物质氧化，形成大量的红褐色或者黄色铁氧化物及其氢氧化物覆盖在根表上，即铁膜。

水稻根表铁膜一般出现在距根尖1.0cm的地方，主要出现在根毛区、根伸长区及根上较靠后部的部位。影响水稻根表铁形成的因素包括：土壤溶液中Fe²⁺浓度、根系分泌的氧气和氧化性物质总量以及由此形成的微氧化环境、土壤中无机碳、可溶性盐、土壤有机质、阳离子交换量、碳酸盐含量、pH值、Eh值、生长季节、温度和淹水时间长短等。

根表铁膜主要由晶态或无定态铁的氧化物或氢氧化物(如氢氧化铁、纤铁矿与针铁矿)组成。根表铁膜由于含有铁氧化物，可吸附根际环境的金属、类金属元素，作为水稻对重金属吸收的一种有效屏障。

根表铁膜缓解植物受到金属毒害的机制主要有两个方面：一方面即为铁膜的物理化学吸附能力能使有毒元素束缚在植物根表不易被植物吸收；另一方面则是铁膜能提供除有毒元素外的其他元素离子进入植物体内，预先饱和有毒元素的结合位点，减少对有毒离子对植物的毒害。水稻根系作为污染物进入植物体内的重要门户，研究根表铁膜的作用机理及其形成的调控机制有重要意义，为正确评价重金属迁移转化行为提供合理的依据。

现有的研究表明微生物广泛参与了铁膜形成以及其表面元素循环过程。铁氧化细菌和甲烷氧化细菌对于根表铁膜的形成起到了一定的作用。目前针对根表铁膜微生物的研究主要方法为显微观察和富集培养等方面。然而可培养的微生物只占到自然界微生物总量的1％不到。需要全面了解水稻根表铁膜相关微生物就需要利用基于现代分子生物学技术的非培养方法，此类方法需要提取到高质量的环境DNA。

由于铁膜具有两性，能吸附带有正负电荷的基团及其离子，并且铁膜上往往吸附有大量的重金属，影响着DNA提取溶液离子形态以及细菌裂解，释放的DNA也可能被铁膜所吸附，如此造成铁膜DNA提取的困难。

发明内容

本发明的首要目的提供一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，本申请从水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征出发，针对野外样品保存、铁膜分离溶解、微生物滤膜回收、细胞裂解及DNA提取过程对所需试剂做了较大改进。

本发明的另一目的在于提供上述试剂在水稻根表铁膜微生物DNA提取中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，包括清洗液(FPCB)、溶解液(FPDB)、裂解液(FPLB)、洗涤液(FPWB)和洗脱液(FPEB)；该组试剂是根据水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征设计得，其中的清洗液(FPCB)用于洗去根际表面土壤；裂解液(FPLB)用于裂解吸附于铁膜上的微生物细胞；洗涤液(FPWB)用于洗去裂解液中可能存在的大量铁等金属离子。