[发明专利]一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒，属于分子生物学领域。所述试剂盒包含ComF、3A‑R、15A‑R和NIV‑R四种引物，分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明的试剂盒重复性好，特异性高。本发明还公开了上述试剂盒在鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型中的应用，准确性高，操作简单，适用于禾谷镰刀菌产毒基因型的快速鉴定。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地，涉及一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用。

背景技术

小麦赤霉病是一种严重的植物病害，在世界范围内广泛流行，在我国的长江中下游地区、华南地区以及东北地区等小麦产区均有发生。小麦赤霉病会影响小麦的产量，并且真菌分泌的毒素会引起呕吐等症状，可能有致癌的危害。

禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要病原菌，属于半知菌亚门镰孢属真菌，单个孢子是无色的，大型分生孢子呈镰刀型，主要产生B型单端孢烯族毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，其中DON的乙酰化产物包括3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3Ac-DON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15Ac-DON)两种。根据所产毒素类型的不同，禾谷镰刀菌菌株被划分为3Ac-DON型、15Ac-DON型和NIV型三种基因型。开展禾谷镰刀菌产毒基因型快速鉴定方法研究对进行小麦等谷物中真菌毒素污染风险评估研究，有针对性地开展病害及毒素污染防控工作具有重要的指导意义。然而，目前尚没有能够快速鉴定谷镰刀菌产毒基因型的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人的目的是提供快速对禾谷镰刀菌的毒素化学型进行检测的试剂盒。为此，发明人进行了大量的研究，开发了可用于禾谷镰刀菌毒素化学型分子鉴定的特异性引物，通过对禾谷镰刀菌DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，获得特异性条带来区分毒素的化学型。

本发明第一方面提供一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒，包含由引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R组成的引物组合，其中，引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTPs和PCR缓冲液。

在本发明的另一些实施方案中，所述试剂盒还包含2×EasyTaq PCR SuperMix。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述的试剂盒在快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型中的应用。

在本发明的一些实施方案中，快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型包括以下步骤：

获取待鉴定禾谷镰刀菌的基因组DNA；

以所述DNA为模板，利用权利要求1所述的试剂盒进行PCR扩增；

检测PCR扩增产物，以确定禾谷镰刀菌产毒基因型。

在本发明的一些实施方案中，利用测序法检测PCR扩增产物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述测序是指Sanger法测序。

在本发明的另一些实施方案中，利用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物。

在本发明中，如果PCR扩增产物为836bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1116bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1404bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生雪腐镰刀菌烯醇。