[发明专利]一种利用内质网滞留信号肽提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体

说明书

本发明公开了一种利用酵母内质网滞留信号肽提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体，属于抗体工程技术领域。本发明利用GAL1‑GAL10双向启动子载体同时表达Adalimumab或Infliximab的VH‑CH1和VL‑CL两个结构域，通过氨基端内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再利用Aga1‑Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。同时，通过将酿酒酵母内质网滞留信号肽融合到Fab片段VL‑CL结构域的羧基端，明显提高了酵母细胞表面展示的Fab片段结合抗原的能力，促进了功能性Fab片段的展示，从而更适用于Fab片段的酵母细胞表面展示，为抗体工程中Fab的改造方法提供了一种优化策略。

技术领域

本发明涉及一种利用内质网滞留信号肽提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体，属于抗体工程技术领域。

背景技术

抗体是机体在抗原刺激下由免疫细胞分泌的可与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。单克隆抗体是目前最具有经济价值的生物治疗药物之一，被广泛用于治疗病毒感染、免疫疾病和癌症等。目前，生产抗体的方式主要有两种，传统的动物免疫和抗体工程。一般动物免疫产生抗体的方法大多比较耗时，并且成本昂贵。因此，抗体工程技术逐渐发展起来，包括噬菌体展示、核糖体展示和细胞展示技术等，被应用于抗体的生产和改造。其中，酵母细胞表面展示技术因是真核表达宿主，并且可以结合流式细胞仪的高通量筛选技术等优势，被广泛用于多种形式的抗体文库的改造和筛选。

目前抗体酵母展示片段主要有两种形式，包括单链可变区片段(single-chainvariable fragment,scFv)和抗原结合片段(Fragment ofantigen binding，Fab)。ScFv是由抗体重链和轻链可变区通过15-20个氨基酸短肽连接而成的具有抗体活性的最小功能结构。scFv具有分子量较小、易于制备、细胞穿透力强等优点。但同时，有些scFv稳定性较差、半衰期短、亲和力低；并且scFv中连接VH和VL区域的非天然人工接头有可能会影响其对抗原的识别，进而在转化为成熟的抗体(Immunoglobulin，IgG)形式时，会出现假阳性的结果[Yang,Z.,et al.,“Affinity maturation of an TpoR targeting antibody in full-length IgG form for enhanced agonist activity”,Protein Eng.Des.Sel.,2018,31(7-8),233-241]。而Fab是由重链的VH-CH1结构域与完整的轻链VL-CL通过分子内的二硫键连接组成的抗原结合片段。Fab结构相比于scFv更稳定，更接近成熟的抗体形式，从而对抗原有较高的亲和力。同时，由于去除了非天然人工接头，可以有效降低突变体在转化为成熟的抗体形式时的假阳性。