[发明专利]一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌:取1mL待测样品于1.5mL离心管中,投入免疫磁珠300μL混匀；垂直混匀仪上室温孵育30min后，将其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，将上清液弃去，取下磁力架上的离心管，加入1mL的0.01mol/L PBS洗涤悬浮，充分混匀，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，弃去悬浮液，重复洗涤3次，加入1mL 0.01mol/LPBS震荡重悬磁珠，将富集得到的磁珠-菌体复合物用于后续的DNA提取及环介导等温扩增法(LAMP)的检测；

2)对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取:采用市售的DNA提取试剂盒提取磁珠-菌体复合物的DNA，其原理是基于硅胶柱纯化方式，利用试剂盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黄色葡萄球菌的细胞壁，在裂解液和蛋白酶(Proteinase K)作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中；加入乙醇后，转移至吸附柱(Column)中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除；吸附柱经洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于后续的LAMP的检测；

3)对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测:使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，30个循环；反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，若出现“S”形曲线则为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。

2.如权利要求1中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤1)中所用免疫磁珠的制备方法为：

颠倒混匀PBS溶液中的500nm链霉亲和素磁珠，吸取50μl的链霉亲和素磁珠加入1.5ml灭菌离心管中；然后加1ml 0.01mol/LPBST缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；

将磁珠重悬于1ml 0.01mol/LPBST缓冲液，加入20μl含生物素标记的金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，垂直混匀仪上轻柔振荡，在室温下孵育45分钟；

在磁场吸附，弃去上清液；后加入0.01mol/LPBST缓冲液(每次1ml)洗涤磁珠3次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；

最后将磁珠重悬在含有0.02％Na3N，0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液中，用于后续实验，免疫磁珠保存于4℃冰箱，尽量在一周之内使用。

3.如权利要求1中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤3)中的LAMP反应体系设置为25μL，按照N+2个数量计算各组分用量，其中N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照，将反应液置于1.5mL离心管中，漩涡混匀，离心30秒，分装于0.2mLPCR管中，并向每管加入约20μL矿物油，然后加入2μL提取的金黄色葡萄球菌基因组，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。

4.如权利要求3中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，LAMP反应体系成分为：2×RM反应液12.5μL，ddH2O8μL，引物1μL，SYTO-9工作液0.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，待检测DNA2μL。

5.如权利要求3中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述引物序列如下：

F3引物：GGATGGCTATCAGTAATGTT；

B3引物：GCTAAGCCACGTCCATAT；

FIP引物：ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA；

BIP引物：AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC；

LoopF引物：TGCTGAGCTACTTAGACTTGAA；

LoopB引物：AGGTCAACCAATGACATTCAGA。

6.一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：免疫磁珠，DNA提取试剂，LAMP反应液，阳性对照和阴性对照。