[发明专利]一种用于评价鱼类植物性饲料的抗营养因子效应的方法

权利要求书

1.一种用于评价鱼类植物性饲料的抗营养因子效应的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗营养因子对Caco-2细胞生存的影响

采用豆粉作为阳性对照，在Caco-2细胞培养液中添加抗营养因子，根据饲料中所含抗营养因子的浓度范围设置其添加浓度，培养24-48小时，结晶紫染色细胞DNA，统计Caco-2的死亡面积，若死亡面积超过5％，则判断该抗营养因子具有细胞毒性；

(2)抗营养因子的免疫学细胞效应分析

采用豆粉作为阳性对照，ELISA法测定Caco-2细胞培养上清中细胞因子浓度，包括促炎因子IL-1beta、TNF-alpha、IL-6、IL-8，具体方法如下：

a.豆粉：利用transwell细胞共培养体系将豆粉按25mg/mL加入Caco-2细胞培养液，培养24～48小时，收集培养物的上清液，离心取上清，采用ELISA检测促炎因子的蛋白量；

b.可溶性抗营养因子，包括蛋白类抗营养因子、寡糖类抗营养因子、生物碱类抗营养因子，直接在Caco-2细胞培养液中添加不同浓度的抗营养因子，培养24～48小时，收集培养物的上清液，离心取上清，采用ELISA检测促炎因子的蛋白量；

c.异黄酮类抗营养因子采用二甲亚砜作为助溶剂，在Caco-2细胞培养液中添加不同浓度的抗营养因子，培养24～48小时，收集培养物的上清液，离心取上清，采用ELISA检测促炎因子的蛋白量；

(3)抗营养因子对鱼类肠粘膜免疫系统的急性效应分析

在斑马鱼胚胎培养液中添加不同比例的抗营养因子，将7dpf的双荧光标记的转基因斑马鱼鱼苗放置在培养液中浸泡24小时，通过荧光成像统计分析中性粒细胞和巨噬细胞在肠道的聚集情况，并通过统计荧光的光密度和面积，计算校正荧光总量，分析抗营养因子先天免疫细胞的急性诱导效应；同时通过qPCR检测检测斑马鱼鱼苗的促炎细胞因子IL-1beta和IL-8，以及紧密连接蛋白Claudin b的表达量，结合先天免疫细胞和促炎因子的情况以及紧密连接蛋白的表达，判断肠道免疫和屏障功能的急性改变情况；

(4)抗营养因子对鱼类肠粘膜免疫系统的长期效应分析

生长指标分析：采用2月龄成年AB系斑马鱼，投喂鱼粉饲料作为正常对照，实验组是在鱼粉饲料中添加不同比例的抗营养因子，连续投喂4周，测定生长指标，包括总增重、特定生长率、采食量、饲料效率，通过比较生长指标确定投喂含有抗营养因子的饲料对鱼类生长的长期影响；

肠粘膜基因表达分析：采用肠粘膜免疫屏障中的紧密连接、免疫功能、凋亡相关基因的表达情况作为评价指标，紧密连接基因包括ZO-1、Occludin-A、Claudin 1、Claudin b、Claudin C、Claudin 12、Claudin 15a，免疫基因包括促炎因子NF-kB、TLR4、IL-1beta、IL-8、TNF-alpha以及抗炎因子TGF-beta、IL-10、Foxp3a，凋亡基因包括Caspase3、Caspase8、Caspase9；其中免疫基因在蛋白水平还采用抗体检测免疫蛋白，包括促炎相关的IL-17、CD4、TNF-alpha，以及抗炎相关的IL-10和Foxp3。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白类抗营养因子是通过超声波促溶，温度不超过60℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，异黄酮类抗营养因子所用助溶剂二甲亚砜的最高浓度不超过0.5％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中评价抗营养因子对鱼类肠粘膜免疫系统的急性效应分析中，蛋白类抗营养因子的添加浓度范围为0.08～0.32mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中评价抗营养因子对鱼类肠粘膜免疫系统的长期效应分析中，蛋白类抗营养因子在斑马鱼成鱼饲料中的添加浓度范围为3～12％。