[发明专利]一种罗非鱼肝脏DGAT2基因表达的调控方法

说明书

本发明公开了一种罗非鱼肝脏DGAT2基因表达的调控方法，属于生物化学与分子生物学领域。本发明的方法包括：(1)注射雌二醇；(2)RNA逆转录；(3)实时定量PCR扩增。本发明以DGAT2‑F：5’‑CGTTTCACCACCTTCGTCATC‑3’，DGAT2‑R：5’‑CAGCTGGTAAAGGCCACCAT‑3’为特异性引物，采用β‑actin作为内参，进行实时定量PCR扩增反应，对罗非鱼DGAT2基因表达结果进行分析。本发明的方法操作简便，适合快速进行大量样本的操作，而且检测试剂价格低廉、易获得，不仅对今后有关罗非鱼脂质代谢研究提供依据，而且为人为调控罗非鱼脂代谢提供了新方法。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种罗非鱼肝脏DGAT2基因表达的调控方法。

背景技术

脂代谢参与多种鱼类生物学过程，如生长、生殖、抗病抗逆等。多项研究表明脂代谢与鱼类生长有关，例如，饲喂高脂的饲料可导致脂累积并影响尼罗罗非鱼的生长速度。脂进入体内后通过内源和外源两个途径进行运输，肝脏是脂代谢的关键部位，它是内源和外源两个途径的关键作用部位。最近的研究表明，脂代谢受多种因子调控，例如水体中的镉离子浓度可促进欧洲鳗鲡的脂吸收能力，除了环境因子和营养因素以外，新的研究也表明激素对脂代谢有普遍的调控作用。

类固醇类激素已经被证明可以调控鱼类的性腺发育以及控制能量代谢、渗透调节、体色、行为、学习和营养吸收等活动。在哺乳动物中，脂代谢被类固醇类激素调控已经得到了广泛研究。在人类中，雌二醇被认为是肥胖和脂代谢的调控因子，雌二醇还可以调节甘油三酯和脂蛋白a的水平，这些线索均表明雌二醇的处理对治疗心脏病和肥胖有意义。此外，雌二醇也可调节哺乳动物的食物摄入与能量平衡。而相对于哺乳类，鱼类类固醇类激素调节脂代谢的研究还较为缺乏。目前关于脂代谢的研究主要集中于饲料中的营养因子对其的调控作用，而雌二醇等激素的调控方法研究还相对缺乏。

二脂酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)是内质网细胞微粒体酶，它催化甘油三酯生成，是甘油三酯生成过程中的最终限速酶。DGAT2与多种疾病以及生长发育相关，例如敲除DGAT2基因的小鼠会在出生不久后由于缺乏TG而死亡。在人体中，DGAT2高表达与高甘油三酯水平有关，可以引起肥胖症、高血糖、冠心病等脂代谢异常疾病。DAGT2可作为这些代谢疾病的治疗和诊断靶标之一。由于DGAT2在甘油三酯合成中的重要作用，近年来在水产动物中被广泛研究。

雌二醇是一种类固醇类性激素，有α和β两种构型，其中17β-雌二醇在动物体内活性最高。雌二醇在动物食物摄入和能量稳态调节等方面都具有重要意义。在哺乳动物中，雌二醇主要由性腺分泌且被认为与脂代谢有密切关系，例如它可以调节切除卵巢大鼠的甘油三酯水平以及绝经后女性脂代谢紊乱的状况。此外，雌二醇不单单存在于体内，也存在于环境中。环境中的雌二醇大多为脂溶性，可通过摄食作用最终富集到人体中，而这种雌二醇难以降解并且不易排出，并可与自身分泌的雌二醇竞争性地与雌二醇受体结合，最终导致细胞发生功能性改变。雌二醇不仅对哺乳动物产生影响，而且可作用于鱼类活动。它具有参与鱼体内能量代谢、氧化应激、异生素代谢和脂代谢等作用。有报道称用雌激素处理斑马鱼后，斑马鱼肝脏甘油三酯含量和脂肪酸合成酶基因的明显上调。这些结果都表明雌二醇可以调节脂代谢水平。

罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优良品种之一，具有生长速度快，繁殖能力强，耐低氧等优良性状。罗非鱼现已成为我国主要淡水养殖鱼类之一，近年来我国罗非鱼产业发展较为迅速，已成为全球第一大罗非鱼养殖国。目前，我国罗非鱼产业主要集中于广东，广西和海南三省，并且以出口为主，内销为辅。然而近年来由于养殖条件改善，养殖罗非鱼出现了脂质过剩现象，引起罗非鱼代谢紊乱，出现高脂肪、高胆固醇等问题。因此，研究并调节罗非鱼脂代谢水平，对提高养殖鱼品质显得尤为重要。通过调节罗非鱼DGAT2基因从而控制罗非鱼脂代谢紊乱现象，不仅对今后有关罗非鱼脂质代谢研究提供依据，而且为罗非鱼人为调控脂代谢提供了新方法。