[发明专利]一种基于随机序列利用载体筛选活性增强子的方法

权利要求书

1.一种增强子筛选表达载体，其特征在于，该增强子筛选表达载体用于对随机序列中活性增强子进行筛选，所述增强子筛选表达载体由穿梭质粒载体改造而成，所述增强子筛选表达载上的核心部件包括mini启动子及其下游的mcherry报告基因，mini启动子上游包含随机序列的重组位点。

2.一种利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、合成随机序列文库；

S2、利用XhOI酶和Hind III酶对增强子筛选表达载体进行酶切，得到线性载体；

S3、利用线性载体和随机序列文库构建质粒文库；

S4、将所构建的质粒文库转染细胞，并基于荧光表达情况，通过流式富集增强子阳性细胞；

S5、对所富集的增强子阳性细胞进行DNA提取，并利用所提取的DNA建库再进行高通量测序。

3.如权利要求2所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，随机序列文库中序列长20-50bp。

4.如权利要求2所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，随机序列文库使用前进行稀释，具体稀释条件为：12000g，RT，离心90s，加无菌水稀释成浓度为50ng/ul的溶液。

5.如权利要求1所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，步骤S2中酶切体系为：NEBuffer2.1，5ul；XhoI，2ul；Hind III，2ul；DNA，20ug，加双蒸水至体系为50ul。

6.如权利要求4所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：

利用同源重组酶对线性载体和随机序列文库进行同源重组，并将重组质粒加入到感受态细胞中，之后利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。

7.如权利要求5所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：

从液氮中取出细胞293T，空气中放置10-15s，在37℃水浴锅中快速解冻，将细胞悬液转移到离心管中，200g，RT，离心5min；弃上清，加完全培养基重悬细胞，然后置于培养箱中；

待细胞生长到80％-90％汇合度时，使用脂质体试剂转染细胞，48h后观察荧光表达情况，其中，每个100mm培养皿加入2ml消化酶消化细胞2min，加入2ml完全培养基终止消化，200g，RT，离心5min；弃上清，加入5ml DPBS洗涤一次，再次离心收集细胞；利用流式分选细胞仪富集增强子阳性细胞。

8.如权利要求6所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，所述步骤S5中对所富集的增强子阳性细胞进行DNA提取具体为：

将富集的增强子阳性细胞2000g，RT，离心5min，弃上清；在细胞沉淀中加入600ul细胞裂解液，70ul 10％SDS，5ul蛋白酶K，轻轻上下颠倒数下，混匀后放在56℃的烘箱内孵育1h，其间不间断轻轻振荡使其消化完全；

加入等体积平衡酚，上下轻轻颠倒混匀，13000g，离心10min，吸取上清液于新的EP管里；

加入等体积氯仿：异戊醇混合液，上下轻轻颠倒混匀，13000g，RT，离心10min，吸取上清液于新的EP管内；

在上清液中加入两倍体积的-20℃冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少1h，13000g，RT，离心15min，弃上清液；

加入500μl的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000g，RT，离心2min，吸去上清液；

将管倒立在卷纸上，晾干DNA沉淀块，除去残余乙醇；

加入适量TE缓冲液或灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，保存以备电泳检测。

9.如权利要求7所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其特征在于，所述步骤S5中利用所提取的DNA建库具体包括：

根据载体设计扩增引物，并利用高效扩增酶以及PCR扩增程序扩增基因组DNA，再进行切胶回收纯化目的条带；将第一步的胶回收产物利用建库试剂盒进行扩增，并在扩增的产物加上测序用接头。