[发明专利]一种基于随机序列利用载体筛选活性增强子的方法

说明书

本发明公开了一种增强子筛选表达载体及利用随机序列筛选增强子的方法所述增强子筛选表达载体由穿梭质粒载体改造而成，增强子筛选表达载上的核心部件包括mini启动子及其下游的mcherry报告基因，mini启动子上游包含随机序列的重组位点。本发明提供一种增强子筛选表达载体及利用随机序列筛选增强子的方法，该方法利用增强子筛选表达载体和筛选文库实现对增强子序列的有效鉴别，相较于现有技术，该方法对基因组中增强子的鉴定准确率大幅提升，同时该方法能够针对几十bp序列中的增强子进行有效鉴定，对于深入理解基因表达调控的机制具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种增强子筛选表达载体及利用随机序列筛选增强子的方法。

背景技术

真核生物的基因表达是一个精细，复杂且处于动态变化的过程，它受到基因组转录因子，表观遗传修饰各种调控元件等多因素的复杂调控从而执行各种基因时空特异性表达。其中顺式调控元件通过招募不同的反式作用因子使染色质高级结构发生变化，从而启动或沉默基因的表达，是近些年基因调控研究的热门领域，因此，对于基因组中顺式调控元件的鉴定对于深入理解基因表达调控的机制具有重要意义。

增强子是一类具有重要作用的顺式调控元件，对基因的表达调控具有重要作用。对增强子的基因组特征进行描述是DNA元件百科全书项目(ENCODE)的重要内容。为此，现在已经开发出了很多方法，如染色质免疫沉淀(chip-seq)，DNaseI高敏感位点测序(DNase-seq)，甲醛辅助分离调控元件技术，染色质开放性测序技术(ATAC-seq)以及STARR-seq(自我转录活性调控区测序)，总的来说，这些技术主要是依靠组蛋白修饰或染色质可获得性的染色质特征，并认为这些是增强子位点的基本特征，但是由于染色质特征的复杂性以及分析方法的原因，这种对基因组中增强子的鉴定不是很准确。

目前，已经定义的增强子元件大多数在几百个碱基对(bp)以上，例如H3K27acchip-seq的覆盖度范围为200-60Kbp(如新定义的超级增强子)，如此庞大的区域可能包含多个信号。同时，通过对这些不同基因组数据集的motif分析，我们发现每个位点的核心区域仅为几个或几十bp长度。众所周知，由于染色体中核小体本身结构的特征这些传统的方法无法做到比147bp更短的序列，用现有的技术去鉴定基因组中的核心增强子是一件几乎不可能实现的事情。

因此，现有技术有待于进一步发展。

发明内容

本发明目的是针对上述问题，提供一种增强子筛选表达载体及利用随机序列筛选增强子的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种增强子筛选表达载体，其中，该增强子筛选表达载体用于对随机序列中活性增强子进行筛选，所述增强子筛选表达载体由穿梭质粒载体改造而成，所述增强子筛选表达载上的核心部件包括mini启动子及其下游的mcherry报告基因，mini启动子上游包含随机序列的重组位点。

一种利用随机序列筛选核心增强子的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

S1、合成随机序列文库；

S2、利用XhOI酶和Hind III酶对增强子筛选表达载体进行酶切，得到线性载体。

S3、利用线性载体和随机序列文库构建质粒文库；

S4、将所构建的质粒文库转染细胞，并基于荧光表达情况，通过流式富集增强子阳性细胞；

S5、对所富集的增强子阳性细胞进行DNA提取，并利用所提取的DNA建库再进行高通量测序，

所述利用随机序列筛选核心增强子的方法，其中，随机序列文库中序列长20-50bp。