[发明专利]硫辛酸手性醇中间体的制备方法及其新酶催化剂的制备方法

说明书

硫辛酸手性醇中间体的制备方法及其新酶催化剂的制备方法。本发明一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用，该催化剂可以在很温和的条件下将8‑氯‑6‑羰基辛酸乙酯转化为R‑硫辛酸手性醇中间体，并且极具选择性，使得产物的手性纯度值达到99%以上，反应时间可以控制在24小时以内，有很好的工业应用背景，使得R‑硫辛酸手性醇中间体的制备简易化，步骤也不复杂，而且能够大大降低环境污染。

技术领域

本发明涉及一种酮还原酶涉及用于硫辛酸手性醇中间体及类似物生产的新型应用，属于生物酶工程和微生物应用领域，具体涉及硫辛酸手性醇中间体的制备方法及其新酶催化剂的制备方法。

背景技术

α-硫辛酸(α-lipoic acid)，CAS:1077-28-7,化学名为5-(3’-(1’,2’-二硫杂环戊烷))-戊酸，是一种不溶于水的黄色结晶，略有气味。α-硫辛酸是一种新型的抗氧化剂，是人体新陈代谢中三羧酸循环过程中不可缺少的一种物质。不仅参与能量代谢，还可以消除人体内活性自由基和活性氧等有害物质。

R,S型硫辛酸分子式结构

硫辛酸具有R和S两种构型，研究发现，R-(+)-硫辛酸有生理活性，S型没有生理活性。

因而(R)-构型手性醇中间体B的制备是R-(+)-硫辛酸合成的关键步骤。

目前R-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。随着环保要求日益提高，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。

酶法合成R-手性醇中间体的研究已有报道。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备R-手性醇中间体。Yu-Jun Zhang,et al于2015年克隆一个来源于Candida par apsilosis的酮还原酶CpAR2，用于还原8-氯-6-羰基辛酸乙酯制备手性醇中间体R-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，手性纯度值大于99%,浓度330g/L，收率86%，有望用于工业化生产。但其收率还有进一步提高的空间，国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种来源于赤红球菌菌属Rhodococcus ruber的酮还原酶Lk Kred基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法，以及该酶作为生物催化剂用于制备R-硫辛酸手性中间体及其类似物的方法。

酮还原酶Lk Kred的核苷酸序列如附件中SEQ ID No.1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为附件中SEQ ID No.2所示。

具体技术方案如下：

一种新酶菌株的制备方法，具体步骤为：

步骤一：在酮还原酶Lk Kred、葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、醇脱氢酶(TbADH)基因编码两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；

步骤二：在表达载体的基因编码两端添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；

步骤三：将步骤一中经过双酶切的Lk Kred与步骤二中双酶切的表达载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒；