[发明专利]一种腺病毒颗粒获得方法

权利要求书

1.一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：具体操作步骤如下：

S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；

S1.1、根据NCBI hTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；

S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；

S1.3、参照高保真DNA聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；

S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshuttle-cmv进行酶切，得到酶切产物胶，回收后使用T4连接酶连接得到连接产物，接着将连接产物加入Trans-T1感受态细胞中将其转化，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用PmeI酶切鉴定抽提的质粒，将鉴定为阳性的质粒进行测序；

S2、BJ5183/p超级感受态的制备；

S2.1、采用热激法将质粒pAd-Easy-1转化成BJ5183感受态，然后涂氨苄霉素琼脂板，挑取单克隆；

S2.2、采用Inoue方法制备含pAd-Easy-1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p；

S3、同源重组腺病毒质粒构建；

S3.1、用PmeI酶切pshuttle-cmv-TERT质粒使其线性化，然后采用热激法将其转化成超级感受态BJ5183/p；

S3.2、涂氨苄抗性琼脂板，挑取10个菌落较小的单克隆，进行摇菌，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用pacI酶切鉴定抽提的质粒，将重组成功质粒扩增；

S4、腺病毒颗粒收集；

S4.1、将生长状态好的293细胞按1:3传代；

S4.2、第二天细胞生长达50％时，按FuGENE6 Transfection Reagen转染试剂盒说明书将重组质粒转染293细胞；

S4.3、6-8天后将细胞及上清反复冻融3次后离心，收集上清，再感染293细胞；

S4.4、6-8天后收集细胞上清，使用过滤器过滤，分装冻存于-80℃冰箱。

2.根据权利要求1所述的一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，上游引物为5’-CTAGGGTACCATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’。

3.根据权利要求1所述的一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，下游引物为5’-CTAGAAGCTTTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCT-3’。

4.根据权利要求1所述的一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：所述步骤S2.1中，涂氨苄霉素琼脂板后的11.5-12.5h内挑取单克隆。

5.根据权利要求1所述的一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：所述步骤S3.2中，涂氨苄抗性琼脂板后的11.5-12.5h内挑取10个菌落较小的单克隆。

6.根据权利要求1所述的一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：所述步骤S4.4中，过滤器采用微孔滤膜进行过滤，且微孔滤膜的过滤孔径为0.2μm-0.22μm。