[发明专利]一种腺病毒颗粒获得方法

说明书

本发明公开了一种腺病毒颗粒获得方法，具体涉及腺病毒获取领域，具体操作步骤如下：S1、pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S4、腺病毒颗粒收集。本发明通过pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。

技术领域

本发明涉及腺病毒获取技术领域，更具体地说，本发明涉及一种腺病毒颗粒获得方法。

背景技术

近年来的研究发现PDLCs有类似间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)功能的细胞，能在体外分化为成骨细胞，脂肪细胞及神经样细胞，使牙周组织的再生成为可能，遗憾的是牙周膜的再生机制尚不明晰。牙周膜的再生研究方面，主要受限于原代PDLCs的传代培养会降低细胞的分化潜能，并失去原代特性，比如，不同代数牙周膜的成骨分化能力差异非常大。所以建立与原代PDLCs表型和生长特性相同，并能稳定传代的PDLCs细胞系，对牙周膜再生机制的研究提供细胞平台，有着重大的意义。

构建保留原代细胞特征的稳定的人PDLCs细胞系存在诸多难点。Kamata等人通过共转染hTERT和人乳头状瘤细胞病毒16成功构建了人PDLCs系，可是这些细胞失去了钙化潜能。本研究组在前期研究中发现，通过导入各种抑癌基因以期构建稳定的细胞系时，细胞的形态，生长状态都可能发生改变。而人端粒反转转录酶(Humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)是细胞内正常基因，诱导端粒长度伸长并延伸体细胞的复制寿命，相对于传统的永生化基因，端粒酶转染建立的细胞系是正常细胞而非转化细胞，具有正常的核型和生长速度。

研究表明，通过慢病毒过表达hTERT可以构建PDLCs细胞系，但hTERT基因片段大，重组病毒的滴度不高，表达hTERT效率低，效果不理想。而重组腺病毒是比较高效和可靠的重组病毒表达系统之一，其病毒滴度高，可以更有效地介导hTERT的表达。

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55X103Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。

现有技术中腺病毒颗粒获得需要人工培养，获取腺病毒颗粒不稳定，培养的效率不高。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种腺病毒颗粒获得方法，通过pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种腺病毒颗粒获得方法，具体操作步骤如下：

S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；

S1.1、根据NCBI hTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；

S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；

S1.3、参照高保真DNA聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；