[发明专利]一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法

权利要求书

1.一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取类胡萝卜素；

2)浓缩提取液；

3)分离主要类胡萝卜素；

4)鉴定主要类胡萝卜素；

5)测定主要类胡萝卜素的含量。

2.如权利要求1所述一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于在步骤1)中，所述提取类胡萝卜素的具体方法为：将组织样品放入真空冷冻干燥机干燥48h，用研磨机或研钵磨成粉末，称取0.7～1.5g足肌粉末后溶于20ml乙酸乙酯，加入0.02g2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，匀浆5～10min，4000r/min冷冻4℃离心5～10min，取上清液；以上匀浆、离心、取上清的步骤重复3次，以充分提取样品中的类胡萝卜素，将上清液收集于梨形瓶中，提取过程全程避光，以避免类胡萝卜素在光照作用下降解和异构化。

3.如权利要求1所述一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于在步骤2)中，所述浓缩提取液的具体方法为：将步骤1)所得上清液进行旋蒸浓缩，使用溶剂工作站将浓缩液干燥成粉末，保存于-20℃冰箱中；所述旋蒸浓缩的条件可为：冷冻机温度＜10℃，水浴锅温度＜33℃；所述溶剂工作站可为GecVacEZ-2plus，程序：LOW BP；温度＜33℃；time to final stage：30～40min；final stage：30～40min。

4.如权利要求1所述一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离主要类胡萝卜素的具体方法为：使用高效液相色谱仪，接入反相色谱柱ZorbaxSB-C18分离橙红色西氏鲍体内类胡萝卜素种类，条件为柱温，25℃；进样体积，20μl；流动相，按体积比，乙腈︰甲醇︰二氯甲烷溶液＝40︰56︰4；流速1.0ml/min；为进一步优化分离效果，使用正相色谱柱YMC-Pack SIL column优化分离效果，流动相为正已烷和乙酸乙酯进行梯度洗脱，采用线性梯度洗脱：1)正已烷︰乙酸乙酯＝40︰60，10min；2)正已烷＝100，5min；3)正已烷︰乙酸乙酯＝40︰60平衡5min，柱温，25℃；流速1.5ml/min。

5.如权利要求1所述一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于在步骤4)中，所述鉴定主要类胡萝卜素的具体方法为：为鉴定分离得到的主峰，利用液相色谱-质谱联用仪，采用正离子模式进行ESI-MS分析确定其分子量，质谱分析条件与步骤3)反相色谱条件一致；根据其分子量推断步骤3)得到的主峰为玉米黄质或叶黄素，通过比对玉米黄质、叶黄素、β-胡萝卜素标准品确认橙红色西氏鲍主要类胡萝卜素种类。

6.如权利要求1所述一种橙红色足肌西氏鲍类胡萝卜素鉴定与含量测定方法，其特征在于在步骤5)中，所述测定主要类胡萝卜素的含量的具体方法为：通过步骤3)和4)得到橙红色足肌西氏鲍体内主要类胡萝卜素种类为玉米黄质与β-胡萝卜素，将步骤2)所得类胡萝卜素粉末溶于2ml乙酸乙酯，用0.22μm孔径的滤膜过滤制成待测样品；使用高效液相色谱仪，接入正相色谱柱YMC-PackSIL，柱温25℃，流动相为正已烷和乙酸乙酯进行梯度洗脱；采用线性梯度洗脱：1)正已烷︰乙酸乙酯＝40︰60，10min；2)正已烷＝100，5min；3)正已烷︰乙酸乙酯＝40︰60平衡5min，流动相流速：1.5ml/min，在446nm处测定吸光值；将1.0mg玉米黄质标准品分别溶于5.0ml乙酸乙酯，制成200μg/ml的标准品原液，用乙酸乙酯稀释原液，制备成浓度分别为1.25、2.5、5、10、25、50、100μg/ml的工作液；用高效液相色谱仪测量各浓度工作液在446nm处吸光值，得到标准曲线，利用标准曲线获得样品内玉米黄质浓度，使用步骤1)中组织粉末重量数据，计算原组织样中玉米黄质浓度；β-胡萝卜素的测定方法与玉米黄质相似，其区别在于步骤中将工作液浓度改为1.25、2.5、5.0、10.0、15.0μg/ml即可。