[发明专利]交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法

说明书

交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，属于分子诊断技术领域。其包括以下步骤：1）在反应管中加入基础CPA体系：Bst DNA聚合酶反应缓冲液，甜菜碱，Mg²⁺，BstDNA聚合酶，ddH₂O；一套CPA引物系统；不同肉源DNA；2）反应管在63℃恒温水浴锅中扩增60 min后取出，外加各个肉源的特异性外加标记引物6s/a‑n*后，93℃水浴反应3 min，取反应产物在胶体金核酸试纸条上测试。本发明可以不考虑研究对象的个数，只用一个CPA引物体系配合不同物种的外加标记引物，实现多种肉源性成分的同步检测，为满足当今食品安全现场快速检测市场和监管，具有重要的参考应用价值。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法。

背景技术

肉类动物来源的识别影响了食品和肉类生产加工，交易市场和餐饮业等领域。肉类食品安全层面越来越关注低价肉类如猪肉的替代品，以及牛、驴肉、羊肉等价格较高的肉类。肉类的欺诈性标签损害消费者的利益。肉类验证是动物源性食品的质量和安全的主要领域之一。基于鉴定加工和生肉物种方法的开发研究的重要性日益凸显。

CPA是一种核酸等温扩增技术，最初由杭州优思达生物技术有限公司开发(WO2010/080691 A1)。传统的单交叉引物CPA扩增系统依赖于具有链置换功能的DNA聚合酶和一套依据靶序列设计的引物：一条用于在每轮扩增期间引入额外引发位点扩增的交叉引物（2a1s）；两个标记的引物（2a*，3a*）参与扩增并用于检测；一对外围引物（4s，5a）分离单链序列。在适宜酶扩增的温度条件下，扩增产生具有与核酸试纸条检测线特异性结合位点结合的“抗原”产物(2a*1s3s/2s1a3a*）。

已有CPA技术的研究应用于食品医药、防疫检疫领域中病毒、原核生物、真核生物等的检测。 在肉源性成分检测的应用中，传统CPA扩增系统只能针对一种肉源设计其特异的CPA检测体系，利用胶体金核酸试纸条或者其它检测方式将待检测肉源与其它肉源区分，如需进行多种肉源性成分的检测需要多套特异引物体系的设计和多次实验操作，在肉源掺假快速检测或其它检测应用方面还有其限制性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法的技术方案。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在反应管中加入基础CPA体系：Bst DNA 聚合酶反应缓冲液，甜菜碱，Mg²⁺，BstDNA聚合酶，ddH₂O；一套CPA引物系统；不同肉源DNA；

2）反应管在63℃恒温水浴锅中扩增60 min后取出，外加各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*(n=1,2,3...)后，93℃水浴反应3 min，取反应产物在胶体金核酸试纸条上测试。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤1）中CPA引物系统为：以不同肉源的相同基因片段设计的5条通用引物，包括一条交叉引物2a1s，两条内引物3a、2a，一对外围引物4s、5a，其中内引物3a、2a任一标记一条。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤2）中是各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*依据待检测的不同肉源的特异性基因片段设计的外加标记检测引物。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤2）中胶体金核酸试纸条检测区域可设置与各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*的不同外加标记结合的抗原/抗体以阻截不同肉源的产物，从而在不同检测线位置显现结果。