[发明专利]非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒

权利要求书

1.一种用一步反应法快速检测猪组织中非洲猪瘟病毒的核酸免提取的荧光指示的等温扩增试剂盒，该试剂盒具有以下特征：采用一体化的“免提取-等温扩增-荧光指示反应液”，将其与Bst DNA聚合酶和样品混合后，只需一步恒温反应即可得到检测结果；反应液中含有猪组织样品的免提取裂解反应成分，无需另外进行样品核酸提取或处理操作；反应液中含有荧光染色剂来指示反应曲线和反应结果，无需电泳或肉眼观察的操作步骤；所用一体化的“免提取-等温扩增-荧光指示反应液”，其组分包含：SYBR GreenI染色剂、含TritonX-100和Brij-58的pH 8.8的免提取裂解反应液、引物溶液、甜菜碱溶液、dNTP Mixture、MgSO4溶液；试剂盒所用引物溶液包括6条特异性引物，其核苷酸序列如下：

ASFB3：5’-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3’；SEQ ID NO.1；

ASFF3：5’-GCCATTTAAGAGCAGACATT-3’；SEQ ID NO.2；

ASFBIP：5’-GTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTTTGGAGTCATTAATGAAATCTCGC-3’；SEQ IDNO.3；

ASFFIP：5’-GTAAAACGCGTTCGATTTTCCCTTTTGTGGTGGTTATTGTTGGTGT-3’；SEQ ID NO.4；

ASFLB：5’-GATGTAAAGTTCATTATTCGTG-3’；SEQ ID NO.5；

ASFLF：5’-TGATACGTGTCCATA-3’；SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。

3.权利要求2所述的试剂盒的制备方法，具体包括：

（1）引物溶液配制：按权利要求1所述核苷酸序列合成引物，将人工合成引物ASFF3、ASFB3、ASFFIP、ASFBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物ASFLF、ASFLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L；将稀释后的引物按ASFF3:ASFB3:ASFFIP:ASFBIP:ASFLF:ASFLB=0.25:0.25:2:2:0.5:0.5的比例混匀；

（2）荧光等温扩增免提取反应液“免提取-等温扩增-荧光指示反应液”的制备：0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、含Triton X-100和Brij-58的pH 8.8的10倍浓度裂解反应液2.5mL、引物溶液5.5 mL、5 mol/L甜菜碱溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100mmol/L MgSO₄溶液1.5 mL、0.1%DEPC处理水4.5 mL，混匀后用滤膜除菌，分装成小管；

（3）Bst DNA聚合酶的制备：浓度为8U/μL，按1000μL/管无菌分装；

（4）阳性和阴性对照的制备：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒p72基因，构建pMD20-T-VP72载体质粒，对质粒中的p72基因进行序列测定验证后，转化Top10细菌感受态细胞，扩大培养，提取质粒作为阳性对照；以0.1%DEPC水溶液作为阴性对照。

4.根据权利要求1、权利要求2和权利要求3所述的试剂盒在猪组织等产品质量检测和动物卫生检疫中的应用，兽医临床疾病诊断和治疗用途除外。

5.如权利要求4所述的应用，其反应条件为：在反应管中加入荧光等温扩增免提取反应液22μL和Bst DNA聚合酶1.0μL，加入20μL矿物油，再加被检猪血液或组织研磨液样品2.0μL；反应条件参数为64℃、50min，每分钟收集一次荧光信号。