[发明专利]非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒

说明书

本发明选择非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因作为检测靶基因，设计特异性引物，建立荧光等温扩增检测方法并研制成非洲猪瘟病毒核酸免提取的检测试剂盒。本发明采用荧光染料指示扩增反应结果，便于准确判定；使用核酸免提取反应液处理样本，无需提取样品DNA，简化了试验操作、减少交叉污染并能降低成本；整个检测过程速度快，只需50min；一次可检测多个样品；所用的荧光恒温扩增仪器成本低；具有扩增效率高、特异性好的优点；适于在生猪养殖、屠宰、检疫、监测的现场及基层单位使用。

技术领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒核酸荧光等温扩增检测技术及成套试剂盒，属于微生物检测技术领域。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和各种野猪引起一种烈性传染病，强毒株感染后可导致动物100％的死亡率，该病对全球养猪业造成巨大威胁和经济损失。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情，之后该病在我国大多数省份相继发生。由于在世界范围内尚未研发出可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，该病防控主要依赖及时准确的早期病毒检测，彻底扑杀和处理感染猪，以阻止疫病的扩散蔓延。因此，提升检测能力是该病防控的重要措施之一。

检测非洲猪瘟病毒的常用方法是病毒核酸检测，世界动物卫生组织（OIE）推荐了非洲猪瘟病毒的普通PCR和荧光PCR检测技术，但是普通PCR检测操作容易造成病毒核酸扩增产物污染；而荧光PCR技术则需要价格昂贵的荧光PCR仪，从核酸提取到完成全部检测过程，通常需要2个小时以上。因此，这些检测技术不能满足我国当前在养殖和屠宰环节开展现场快速检测的需要。

核酸等温扩增技术是一种新兴的基因扩增技术,与广泛应用的PCR和荧光PCR相比，具有许多优点。该方法不需要贵重仪器（恒温即可）、操作简单、速度快、灵敏度高，因此得到越来越广泛的应用。现有的核酸等温扩增方法，主要依靠肉眼观察反应溶液的颜色变化来判定结果，主观性强、准确性差。本发明采用荧光剂对双链DNA扩增产物进行染色，用阅读仪检测荧光信号来判定结果，提高了准确性；本发明采用免提取反应液，处理并释放样品中的病毒DNA，直接进行扩增反应，不必提取样品中的DNA，减少了操作步骤和成本，缩短了检测时间，消除了核酸提取过程中的交叉污染；本发明针对非洲猪瘟病毒p72基因设计了6条特异性引物，从而保证扩增的特异性。本发明综合运用这些技术，最终建立了新的非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法和试剂盒。本发明相比目前广泛使用的PCR和荧光PCR检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、操作简便、试剂与设备成本低等优点，适合在生猪养殖、屠宰、检疫、监测的现场和基层单位使用。本发明的试剂盒于2019年1月通过中国动物疫病预防控制中心组织的非洲猪瘟快速检测试剂评价，是目前唯一被推荐全国使用的非洲猪瘟病毒等温扩增试剂盒（主要技术内容未公开）,对于该病应急防控发挥了重要作用，具有良好应用前景。

发明内容

本发明的目的是建立免提取核酸的非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法及试剂盒，使检测过程简便易行，结果判读精确，不用借助昂贵仪器，降低检测成本，检测总时间缩短至50分钟，为非洲猪瘟病毒检测提供快速、灵敏、特异、低成本的技术手段。

为实现上述发明目的，本发明采用Bst DNA聚合酶等温扩增技术、组织样本核酸免提取技术和荧光指示剂，建立非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法，研制成试剂盒，具体内容如下：

1.等温扩增引物设计：参考非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株和中国流行病毒株的p72基因序列，筛选保守区域，设计6条引物：

ASFB3：5’-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3’；SEQ ID NO.1；

ASFF3：5’-GCCATTTAAGAGCAGACATT-3’；SEQ ID NO.2；

ASFBIP：5’-GTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTTTGGAGTCATTAATGAAATCTCGC-3’；SEQID NO.3；