[发明专利]甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、H13N6检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；

其中，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10%v/vTritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA；

所述PCR扩增试剂包含：2×PCR buffer、50mM MgCl₂、pH为10.0的100mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、5%g/ml BSA；

所述阳性对照品以HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，以及HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到另一个pUC57质粒载体上，两个质粒分别用DEPC水进行10⁶倍稀释，然后将两个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照；所述阴性对照品为DEPC H₂O；

所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂；

所述H8N7检测试剂包含：H8N7扩增引物和探针；探针H8N7-P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针H8N7-P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

所述H13N6检测试剂包含：H13N6扩增引物和探针；探针H13N6-P1的5’ 端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针H13N6-P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

特异性引物和探针序列为：

H8N7-F1：5’-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’；

H8N7-F2：5’-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’；

H8N7-R1：5’-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’；

H8N7-R2：5’-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’；

H8N7-P1：5’-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’；

H8N7-P2：5’-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’；

H13N6-F1：5’-TCATATTGATTGAGATCTTACG-3’；

H13N6-F2：5’-TGATGACACCTAAGTAATGACT-3’；

H13N6-R1：5’-AGTGCACTGCATTGAACCACA-3’；

H13N6-R2：5’-CCACTGCTCCATGCCCACATTAT-3’；

H13N6-P1：5’-FAM-TGCTCACATGRACTGTAGCCCAGC-BHQ-3’；

H13N6-P2：5’-VIC-ACAGCCTTAATGCTCCACAGCACTGC-BHQ-3’。

2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒，其特征在于：各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。