[发明专利]甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒，试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、H13N6检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；H8N7检测试剂包含H8N7扩增引物和探针；H13N6检测试剂包含H13N6扩增引物和探针。本发明采用的病毒核酸快速提取试剂配方可用于病毒RNA快速提取，大大缩短了提取时间、提升了提取效率，且对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高PCR检测效率；且本发明针对甲型流感病毒H8N7亚型和H13N6亚型的特异性扩增引物探针为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，能够实现高效、精准的分型检测甲型流感病毒H8N7亚型和H13N6亚型。本发明还提供了甲型流感病毒H8N7和H13N6的检测方法，以及甲型流感病毒H13N6的检测试剂盒及检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的多重联合检测方法及检测试剂盒、一种甲型流感病毒H13N6的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒为最常见且最容易发生变异的流感病毒，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒具有两种特异性的囊膜蛋白，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，根据HA和NA蛋白抗原性不同，主要分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。

近年来的研究发现，HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。甲型流感病毒H13N6亚型属于低致病性的流感病毒，其感染对人类的致病性影响不大；而H8N7亚型则是异于普通甲型流感的一种新变种甲型流感病毒，拥有飞沫传播和水源传播的特性，且容易进化为空气传播型，此种病毒的致死率预计达到100％，对人类造成极大的生命威胁。由此可见，针对甲型流感病毒H13N6和H8N7的快速准确地检测及区分对于流感病毒的及时诊断及防御至关重要。

荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，在荧光定量PCR技术平台针对甲型流感病毒H13N6和H8N7的分型检测方法未见报道，因此，本领域技术人员极有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的多重一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒，实现多重联合检测并区分甲型流感病毒H13N6和H8N7亚型。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的的联合检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的提供一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：

一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒，所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、H13N6检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。

优选的，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％v/vTritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA。

优选的，所述PCR扩增试剂包含：2×PCRbuffer、50mM MgCl₂、pH为10.0的100mMTris-HCl、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。

优选的，所述阳性对照品以HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，以及HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到另一个pUC57质粒载体上，两个质粒分别用DEPC水进行10⁶倍稀释，然后将两个稀释后的质粒等体积混合，最终作为阳性对照；所述阴性对照品为DEPC H₂O。