[发明专利]蛋白质的纯化方法

说明书

本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种蛋白质的纯化方法，通过向蛋白质溶液加入一定量的磷酸盐、磷酸根离子(PO₄^3‑)和/或磷酸氢根离子，降低了蛋白产品的电荷异质性，提高了蛋白纯度。

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗体的制备或纯化方法。

背景技术

越来越多的单克隆抗体药物使用哺乳动物细胞(如CHO、BHK等)表达，以确保获得期望的折叠和糖基化。抗体药物常呈现微观不均一性，与小分子药物相比，具有更加复杂的结构。这些微观不均一性，例如“异质性”，包括电荷、分子量大小、形态等相关的异构体等，这些异构体来自于哺乳动物细胞培养、纯化、制剂、储存等生产过程的任何阶段。其中由于抗体分子电荷差异导致的异质性称为电荷异构体。采用离子交换层析方法可将抗体大致分为三组峰，以阳离子交换为例，中间峰为主峰，主峰前的峰为酸性异构体，主峰后的峰为碱性异构体。由于这些异构体可能会对抗体的稳定性、活性、药代动力学、药效、免疫原性及安全性造成影响，因此，在治疗性重组蛋白下游生产过程中，通常使用不同机制的纯化步骤以减少异构体的含量，获得高纯度的单抗制品。

人IgG1和IgG2型抗体大多含有N末端的谷氨酸/谷氨酰胺残基，并会自发的或在酶催化条件下发生环化反应形成焦谷氨酸。在谷氨酰胺的环化过程中，N末端伯胺(中性pH时带正电荷)会转化成中性的酰胺从而导致抗体净电荷的改变，同时伴随着一个NH₃的脱落。因此，未环化的焦谷氨酸变异体可通过阳离子交换色谱检测为碱性异构体，主峰通常为完全环化的异构体。WO2014/161940在利妥昔单抗的纯化过程内将蛋白质的N-端谷氨酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸，其纯化步骤包括(a)用适合的树脂进行蛋白质A捕获，(b)在3.0-4.0范围内的pH值下进行病毒灭活，(c)阴离子交换层析，(d)所述蛋白质的N-端谷氨酰胺和/或谷氨酸转化成焦谷氨酸，(e)用适合的树脂和梯度洗脱物进行阳离子交换层析以分离产物同种型，(f)病毒过滤，和(g)超滤/透滤(UF/DF)。

PD-L1(Programmed death-ligand 1)又称为CD247和B7-H1，是程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)的一个配体。PD-L1在多种肿瘤细胞表面高表达，且肿瘤的恶性程度以及不良预后与PD-L1的表达水平密切相关。在肿瘤微环境中，癌症细胞表面的PD-L1 通过与T细胞表面的PD-1或CD80的结合，抑制T细胞的激活和增殖，促进效应T细胞进入衰竭或无反应状态，诱导T细胞的凋亡，刺激辅助T细胞分化成为调节性T细胞，从而阻止T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。抗PD-L1抗体可以通过阻断PD-L1与PD-1及CD80的相互作用，使得相关的负调控信号不能被启动与传导，从而避免了在肿瘤微环境中的效应T细胞的活性被抑制，使T细胞可以发挥杀伤和抑制肿瘤细胞的功能。由于抗PD-L1抗体能够直接作用于肿瘤组织，因而具有较高的特异性和安全性。目前国际上主要的抗PD-L1单抗药物产品包括罗氏的Atezolizumab和阿斯利康的Durvalumab。WO2016022630公开了一类抗PD-L1 抗体，对PD-L1具有较高的亲和力，能够显著抑制细胞表面的PD-L1和PD-1的相互作用，并显著促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ。因此，为了提高其成药性，迫切需要开发抗体的纯化方法，从而获得可用于临床治疗的抗体。

本发明有效控制了抗体制剂中聚合物的含量以及放置过程中聚合物含量增长、抗体活性维持的问题，从而获得具有高度稳定性的制剂。

发明内容

本发明的目的至少在于提供一种纯化蛋白的方法。具体地，所述方法包括向蛋白质溶液加入一定量的磷酸盐、磷酸根离子(PO₄³⁺)和/或磷酸氢根离子中的一种或几种，调节pH值，在一定温度下孵育。