[发明专利]一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法

说明书

本发明提供一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，在鱼尾采集血液提取线粒体基因组DNA，将核裂解液加入至血液中均质，再添加装有磁珠的蛋白沉淀液进行旋涡振荡，提取上清液后再进行微波震动，获得石斑鱼线粒体基因组DNA，本发明提取DNA完整度高，效率好，浓度高，优化了提取的步骤，缩短提取时间，操作简单，以获得一种快速、经济、效果良好的提取鱼类基因组的方法。

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，特别涉及一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法。

背景技术

石斑鱼，属鲈形目，体长椭圆形稍侧扁。口大，具辅上颌骨，牙细尖，有的扩大成犬牙。体被小栉鳞，有时常埋于皮下。背鳍和臀鳍棘发达，尾鳍圆形或凹形，体色变异甚多，常呈褐色或红色，并具条纹和斑点，为暖水性的大中型海产鱼类。目前，国内外已成功建立从鱼组织、器官中提取高纯度DNA的方法。但是这些方法的缺点很明显，如取材时往往要将研究对象杀死。以鱼类鳍条、鱼血为材料提取DNA虽然不至于使鱼死亡，但由于损伤了鱼类的活动器官使鱼类的正常生活受到影响，对生产造成一定损失，提取操作繁琐，耗时长，且加入过多的有机溶剂，使获取的DNA不够完整。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，解决上述技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，包括以下步骤：

S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL～0.2mL；

S2、将提取后的血液加入核裂解液，倒入研磨珠在压力为25～50MPa的均质器中裂解80～100s，得血液Ⅰ；

S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为4～7：1，在温度为51～75℃下水浴加热溶解30～50min后进行漩涡振荡20-28h，振荡速度为1000～3000rpm，温度为30～40℃，取上清液为血液Ⅱ；

S4、将体积比为2～5：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动1～3h，微波震动频率为500MHz～1000MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

S5、用清水将血液Ⅲ洗涤2～4遍。

进一步的，所述核裂解液为血液体积的4～6倍，包括以下重量份原料：氯化钠30～58份，去垢剂22～39份、蛋白酶抑制剂33～68份。

进一步的，所述去垢剂为质量比1：3～5的地榆多糖、海藻酸钠。

进一步的，所述蛋白酶抑制剂为质量比1.2～2.8：3.2～5.8：1～3.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸。

进一步的，所述蛋白沉淀液由摩尔比为3～5：8～11：5～9的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，通过全血基因组优化提取方法，提取效率高，操作简单，时间短，且不用杀死鱼类，从尾静脉采血不会对鱼的生存造成威胁；添加核裂解液后进行均质器中裂解，分离鱼类红细胞核基因组与蛋白质，有利于提取线粒体基因组DNA。

(2)加入蛋白沉淀液，在磁场的作用下旋涡振荡能够快速的吸附鱼类基因组的核酸分子，使磁性颗粒与溶液分离，反应一段时间之后，再次加入蛋白沉淀液，经过微波震动，蛋白质等杂质不被吸附留在溶液，可以得到高纯度的DNA片段，本发明整个提取DNA的过程不需要离心、不需要有机溶剂清洗，优化了提取的步骤，缩短提取时间，操作简单，以获得一种快速、经济、效果良好的提取鱼类基因组的方法。

具体实施方式