[发明专利]一种S．trachelii的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种S.trachelii的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。该LAMP检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；检测试剂盒包括LAMP检测引物、LAMP反应液。本发明根据S.trachelii的核糖体内转录间隔区设计引物，采用LAMP技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、现场应用方便等优点，解决了现有S.trachelii检测技术中存在的周期长、灵敏度低、成本高、现场应用困难等缺陷，对S.trachelii检疫鉴定、监测和减少对农药盲目使用方面具有重要意义。

技术领域

本发明属于农作物病原菌检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种Stagonosporopsis trachelii(S.trachelii)的环介导等温扩增(LAMP)检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于S.trachelii的快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于S.trachelii的早期诊断和病原菌的检测和鉴定。

背景技术

Stagonosporopsis属的菌种大多为植物病原菌，影响许多重要农作物和观赏植物的正常生长。如S.tanaceti严重影响除虫菊的生长，是澳大利亚除虫菊酯生产的主要生物限制因素之一；三种近缘真菌S.cucurbitacearum，S.caricae和S.citrulli是引起全球黄瓜茎枯病的主要病原菌，侵染至少13属24种的葫芦科植物，包括西瓜、黄瓜、南瓜和葫芦等重要作物。而S.trachelii曾报道在意大利引起彩钟花的叶斑病，2017年本课题组首次在玄参上分离出这种病原菌，田间病株率达87％，影响玄参Scrophularia ningpoensis正常生长，引起玄参叶斑病，严重影响植株的光合作用，导致玄参根部严重萎缩，品质已不能满足中草药加工的标准，影响药用价值，在我们所调查的江苏、贵州、广东三省不同产区均有发生，一旦发现该种病害，经济损失惨重。玄参是我国传统常用中药材之一，国内外市场对于玄参的需求量均呈现与日俱增的趋势，检验检疫性部门应对这种新病原菌的存在引起注意。为了阻止Stagonosporopsis trachelii传播范围的不断扩大，防止该病的大面积爆发，使其引起的病得到控制，开发快速灵敏的检疫鉴定Stagonosporopsis tracheli的技术迫在眉睫。

目前针对Stagonosporopsis trachelii的检测鉴定方法国内外还未有相关报道。一般而言，Stagonosporopsis trachelii的分类鉴定和检测方法主要有传统方法和分子生物学方法两大类，传统方法主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等性状。传统方法在Stagonosporopsis trachelii的检测鉴定中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制；特别是诊断一些致病症状及形态特征极其相似而难以区分的病原菌，给传统的鉴定方法更带来了巨大的挑战。随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为基础的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，如常规PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，现已被广泛使用于鉴定和定量分析各类病毒、细菌、真菌和卵菌病原微生物。然而，该方法检测时间仍然比较长，之后的电泳跑胶费时费力，且需要依赖精密且价值较高的PCR仪，不能满足快速检测的需求。