[发明专利]DiI染料标记示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法

说明书

本发明目的是提供一种不改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能的利用DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体。本发明的有益效果主要体现在：本发明标记方法改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能，可对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行准确示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。

(一)技术领域

本发明涉及DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。

(二)背景技术

DiI即DiIC18(3)，全称为1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，分子式为C₅₉H₉₇ClN₂O₄(结构如式(I)所示)，分子量为933.88，CAS number为41085-99-8。DiI可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF，其中在DMSO中的溶解度大于10mg/ml。是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色，DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参见图1。DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm。试剂4℃避光保存，一年有效。配制的储存液-20℃避光保存，半年有效。

胞外囊泡(Extracellular vesicles，Evs)是由细胞产生的，分泌到细胞外部的发挥细胞通讯作用的脂质双分子层结构。根据囊泡直径大小，分为外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体直径约为40～200nm，是一种重要的细胞远端通讯的方式，几乎所有类型的细胞都能够分泌产生外泌体，包括癌细胞、上皮细胞、脂肪细胞等。在生物体液中，也鉴定发现了外泌体，例如血液、尿液、脑脊液等。外泌体之所以具有重要的细胞通讯作用，是因为外泌体中包装有大量宿主细胞来源的分子，例如蛋白质、mRNA/miRNA和DNA等物质。

随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的研究证明外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。但在利用外泌体进行治疗前，首先要阐明外泌体在体内的生物分布和在细胞中的最终命运。所以迫切需要一种标记方法实现对外泌体体外标记和活体示踪，从而实现在不影响其功能的前提下可视化外泌体，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。

目前为止已有多种标记外泌体的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表现在破坏外泌体的膜结构、改变外泌体的组成成分、影响外泌体的功能等。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种不改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能的利用DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。

本发明采用的技术方案是：

DiI染料标记外泌体的方法，所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体；所述外泌体与DiI染料质量用量之比为：40～60:1。

优选的，所述外泌体为子宫上皮细胞(如Ishikawa细胞或HEC-1-A细胞等)来源的外泌体。

本发明还涉及一种利用所述DiI染料标记外泌体，对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行示踪的方法，所述方法包括：

(1)将子宫上皮细胞来源外泌体与10～30nM的DiI染料37℃孵育30min；