[发明专利]一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法

说明书

本发明公开了一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，涉及生物医疗技术领域，采用miR‑322/‑503或者单独miR‑322或miR‑503及其前体的序列以及高度相似序列，可以直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力；miR‑322/‑503可以抑制毒性RNA水平，可以从根本上治疗DM1；同时，miR‑322/‑503为细胞自身产生的分子，用于细胞和机体的治疗时安全风险较小。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别是指一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法。

背景技术

强直性肌营养不良症I型(DM1)是最常见的成年发病的肌肉萎缩疾病，是由DMPKmRNA的3`UTR区域过度扩增的CUG重复片段导致的。在正常人体内，DMPK mRNA中含有不超过34个CUG重复片段，而在DM1中，DMPK mRNA含有50个以上CUG重复序列，且显示出的疾病症状随CUG重复序列数目增加而更加恶化。含有过度扩增的CUG重复序列的RNA被称为“毒性RNA”。毒性RNA在细胞核内形成类似“发卡”的二级结构，吸附MBNL1蛋白，形成细胞核内焦点(ribonuclear foci)，并导致可发挥作用的MBNL1蛋白和Celf1蛋白水平的改变。MBNL1和Celf1是重要的RNA可变剪切调控蛋白，其水平的改变导致DM1内特征性的异常RNA可变剪切。同时DM1中成肌细胞分化成骨骼肌细胞的能力降低导致DM1中骨骼肌的萎缩和功能减退。由于毒性RNA是DM1的根本致病因素，抑制细胞内毒性RNA的水平是根治DM1的关键。

目前提出治疗DM1方法主要有三种。第一种主要是通过转基因过表达或者敲低的手段恢复正常细胞内的MBNL1和Celf1水平，借以恢复部分的RNA可变剪切模式，从而减轻一些DM1的症状。此方法未能抑制细胞内毒性RNA的水平，无法从根本上治疗DM1，并且通过转基因方式导入外源基因序列影响细胞内蛋白水平存在未知安全风险；第二种主要是通过化学分子、多肽或者小干扰RNA等作用于毒性RNA，使其不能形成“发卡”二级结构或者直接降解，从而达到抑制毒性RNA水平的目的。此方案可以抑制细胞内毒性RNA水平，但引入的化学分子、多肽或者小干扰RNA等均为外源分子，是否会引起细胞和机体的其他不良反应未知；第三种主要是通过基因编辑的手段在细胞基因组上切除编码毒性RNA的DNA片段，此方案可以从根本上去除毒性RNA的来源，但是目前基因编辑的手段尚不成熟，存在脱靶的问题。

申请人发现，目前的三种手段均具有治疗效果有限，并存在较大安全风险的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，以解决现有技术中治疗效果有限，且存在较大安全风险的问题。

基于上述目的本发明提供的一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，包括如下步骤，采用miR-322/-503和/或单独miR-322或miR-503和/或miR-322前体的序列或miR-503前体的序列以及高度相似序列，直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力。

可选的，所述miR-322具有SEQ ID NO.1的碱基序列。

可选的，所述miR-503具有SEQ ID NO.2的碱基序列。

可选的，所述miR-322前体具有SEQ ID NO.3的碱基序列。

可选的，所述miR-503前体具有SEQ ID NO.4的碱基序列。

可选的，还包括采用正向引物和反向引物，依次经过PCR扩增、与pLL4.0载体进行EcoRI酶切、末端处理和胶回收、用T4连接酶进行连接反应、转化大肠杆菌感受态，获的miR-322/-503的表达载体。