[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用

说明书

本发明公开了一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用。本发明的重组毕赤酵母工程菌通过如下方法获得：将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后，转入到毕赤酵母GS115，构建重组毕赤酵母YZ001，随后将SEQ ID NO.4所示的HAC1在毕赤酵母YZ001中过量表达，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。本发明重组毕赤酵母工程菌发酵离心后的上清液可有效用于合成左旋多巴，离心后的菌体可以用于下一批次的发酵，这不仅提高了左旋多巴的合成效率和使用率、节约生产成本，并为左旋多巴的生产加工开辟新的工业化途径。

技术领域

本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用，属于生物工程领域。

背景技术

左旋多巴是一种应用于治疗帕金森病，肝性脑病，神经痛，高泌乳素血症等疾病的常见药物，在医药市场具有巨大的应用价值。目前制备左旋多巴的方法主要有植物提取法，化学合成法和生物酶转化法。但是植物提取法和化学合成法均存在工艺繁琐，成本高，污染环境等缺点。而生物酶催化方法合成左旋多巴绿色环保，集约高效，目前已成为左旋多巴工业化的主要方法。

生物酶转化法主要是以酪氨酸酚裂解酶(TPL)为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸和醋酸氨为底物，催化合成左旋多巴。目前报道的来源于具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、氟式柠檬酸杆菌(Citrobacter frenudii)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、嗜热菌(Symbiobacterium SP.)，克吕沃尔氏菌(Kluyvera intermedia)等的TPL，已经成功在细菌中表达，并应用于生产。

虽然利用细菌表达TPL在工业上已经开始得到了应用，但是仍然受到多方面限制。首先，细菌如大肠杆菌表达TPL之后需要经破壁处理释放胞内的TPL，增加了工艺步骤和能耗，且破壁过程中易造成酶活的降低。其次，细菌容易受到噬菌体感染，容易使得发酵失败。

毕赤酵母作为一类能够利用甲醇为唯一碳源和能源的酵母菌，具有如下优点：1.具有目前最强的启动子，醇氧化酶基因启动子(P_AOX1)；2.表达效率高，其外源蛋白的表达量可占总表达蛋白的90％以上；3.可实现外源蛋白的分泌表达，减少细胞破壁的后处理工序；4.在简单合成培养基中即可实现高密度发酵；5.表达的质粒能整合在基因组中特定位点，遗传特性稳定。6.毕赤酵母表达酪氨酸酚裂解酶不会受到噬菌体感染，避免了倒罐带来的损失。7.以甲醇作为唯一碳源和能源，价格低廉，有利于工业化生产。此外，转录因子Hac1作为内质网响应蛋白，在毕赤酵母中参与转录调控，有研究表明，过量表达Hac1能显著提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量。

基于毕赤酵母的以上优势，开发用毕赤酵母分泌表达TPL来实现工业化生产左旋多巴就显得十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用。

为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌通过如下方法获得：将SEQID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后，转入到毕赤酵母GS115，构建重组毕赤酵母YZ001，随后将SEQ ID NO.4所示的HAC1在毕赤酵母YZ001中过量表达，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。

进一步地，所述重组毕赤酵母工程菌的制备方法具体为：

(1)将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表达载体pPIC9K-TPL，将pPIC9K-TPL线性化后，转入毕赤酵母GS115获得重组毕赤酵母YZ001；