[发明专利]一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用

说明书

本发明构建了肌酸水解酶的突变体，实现了肌酸水解酶比活力和热稳定性的提高。突变体比野生型肌酸水解酶更适合应用于工业化。具有极好的市场应用前景和经济价值。

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用。

背景技术

肌酸水解酶(creatinase或creatine amidohydrolase，EC 3.5.3.3，简称CRE)能催化肌酸水解产生尿素和肌氨酸。目前在多种细菌中均发现肌酸水解酶的存在。肌酐是人体内磷酸肌酸代谢的终产物，它可以经过肾脏的过滤由血液进入尿液而排出体外。血清中肌酐含量的正常范围在35-150μM之间，但是在肾脏功能或肌肉功能出现问题时，肌酐的含量会上升到1000μM。因此血液和尿液的肌酐含量可反映肾脏的排泄功能。相对于化学检测法，酶法检测具有更多的优势。作为酶法检测肌酐含量的关键酶，肌酸水解酶在临床检测肾脏功能中起到非常重要的作用。

由于肌酸水解酶对肌酸的亲和性低，在临床诊断中需要大量的酶，并且昂贵的诱导物是酶生产中的一大障碍，解决这一问题有两条途径。第一、筛选组成性产生或超高产的突变菌株。第二、用分子生物学的方法克隆肌酸水解酶的基因，分析基因结构，构建高产菌株。许多细菌中编码肌酸水解酶的基因己被测序并在大肠杆菌中克隆和表达。高产的重组菌株可使提纯过程简化，并改善酶的性质。

Koyam等(Koyama et al.1990)把黄杆菌Flavobacterium sp.U-188菌株中的肌酸水解酶的基因克隆到Ecoli中，基因在lac启动子的控制下高效表达，酶的产量超过细胞中可溶蛋白的20％，他们的研究表明肌酸水解酶基因序列含有1134bp的开放阅读框，由基因序列推测出的肌酸水解酶的N一末端序列与黄杆菌中肌酸水解酶的N端巧个残基相一致。

Ming Chung Chang等(Ming Chung Chang et al.1992)采用了鉴定指示平板法把恶臭假单胞菌的肌酸水解酶基因克隆到E coli中并表达出重组酶。他们用肌酸水解酶鉴定指示平板法克服了基因克隆重组子筛选的繁琐，鉴定指示平板法是在含有肌酸的培养基中加入0.0l％的酚红，接种的平板在37℃培养24h，菌落直径至少达到2mm后，在菌落的附近接种上奇异变形菌(Proteus mirabilis)37℃培养24h，肌酸水解酶催化肌酸成肌氨酸和脉，奇异变形菌产生脉酶，催化脉产生氨，在培养基上呈现桃红色。因此，肌酸水解酶阳性菌在菌落周围产生桃红色圈。这种方法比从黄杆菌中亚克隆肌酸水解酶的基因，用测定酶活性的方法鉴定和作免疫测定的方法更简单迅速。

Ming Chuan Hong等(Ming Chuan Hong 1998)把嗜水气单胞菌(Aeromonas 匆drophila)的壳多糖酶信号肤基因序列与恶臭假单胞菌NTU-8菌株(Pseudomonas putidaNTU-8)的肌酸水解酶基因序列融合，使肌酸水解酶基因在Ecoli中表达，并把50％的融合酶蛋白送输到周质空间，在肌酸水解酶运出细胞质时，壳多糖酶信号肤己经被脱去，肌酸水解酶具有活性。恶臭假单胞菌NTU-8菌株肌酸水解酶基因的开放阅读框含有1209个碱基，多肤序列含有403个氨基酸残基，分子量为45.7kDa，该基因产物与恶臭假单胞菌NTU-8的肌酸水解酶(45kDa)很相似。

Y Nishiya等((Nishiya et al.1998)对节杆菌TE1826的肌配降解基因簇进行了研究，表明肌配水解酶、肌酸水解酶和肌氨酸氧化酶的基因构成一个基因簇。节杆菌TE1826的肌酸水解酶基因与恶臭假单胞菌DSM2106有63.1％的同源性，与黄杆菌U-188有63.1％的同源性，与枯草杆菌B-0618有77.6％的同源性。恶臭假单胞菌的肌酸水解酶的X一衍射研究表明活性中心在节杆菌和其它种中都是保守的。