[发明专利]一种EB66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基及其制备方法

说明书

本发明属于培养基领域，具体为一种EB66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基，添加剂A中各物质在所述培养基中浓度为：胰岛素1‑10mg/L；IGF‑1 5‑10μg/L；腐胺0.5‑2mg；谷胱甘肽0.5‑5mg/L；乙醇胺1‑5mg/L；β‑巯基乙醇10‑50μM；卵磷脂1‑5mg/L；维生素C 10‑50mg/L；牛磺酸50‑100mg/L；胆固醇2‑5mg/L；谷氨酰胺3‑6mM；每1L培养基中所述氨基酸混合组分添加量为1000mg‑3000mg。该培养基支持EB66细胞在无血清、全悬浮的条件下快速增殖，倍增时间短。细胞呈现较高密度，同时，本发明还提供该培养基的制备方法。

技术领域

本发明涉及培养基领域，具体为一种EB66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基。

背景技术

EB66细胞株是由法国生物科技名企Valneva从鸭胚胎干细胞中提取并驯化的可传代细胞。Valneva总部坐落于法国里昂，致力于疫苗技术研发、生产和商业化创新，在疫苗领域拥有很高的国际影响。Valneva选择未检出内源性逆转录酶病毒表达的鸭子，收集鸭胚胎，提取鸭胚胎干细胞，经过驯化传代得到的基因稳定的EB66细胞株，具有胚胎干细胞源性，无致瘤性，不经过任何基因改造，病毒和化学修饰。

EB66细胞株是鸭胚胎干细胞衍生细胞株，具有干细胞的源性，无致瘤性，已在美国FDA备案，BMF中包括细胞株全部的历史，在多个国家拥有多项专利，在中国申请了五项专利保护。具有全悬浮无血清培养，倍增时间短，可高密度生长，病毒敏感性广等特性。EB66细胞株病毒易感性。

目前，大多数禽类疫苗如AIV、NDV、IBV、EDS等基本依靠鸡胚或鸭胚生产，鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。首先，合格的鸡胚除了能正常生产禽流感病毒外，还应该是健康鸡群产下的受精卵，例如SPF海兰白鸡；其次，生产中一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周年；再者，为确保鸡群在生长过程中没有感染任何禽流感等相关疾病，必须经过定期检测，同时要严格确保受精卵内不能带有任何病毒。受到这些因素的限制，导致无特定病原体(Spedfic Pathogen Free,SPF)的鸡胚产量小、成本高，往往不能满足大批量生产禽流感疫苗的需求。除此之外，鸡胚培养还存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质，而不同质量的鸡胚会对病毒培养产生不同副作用，且鸡胚的来源容易受到禽流感疫情的影响；此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染，己有研究者指出由母体遗传给鸡胚所带来的潜在污染比GMP车间无菌环境中人为操作所带来的污染化率大很多，而这也正是鸡胚培养过程中难以控制的地方。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。

血清能为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入血清替代成分，制备得到的培养基既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。研发一种培养EB66细胞用的无血清培养基，可有效降低后续病毒纯化的分离难度，同时也可有效提高疫苗的安全性。

本公司在多年前就开始了无血清培养基的研究，在专利ZL201510965947.0中，公开了一种用于培养病毒的无血清培养基，该培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80-90％培养液、4-10％氨基酸、3-10％血清替代因子和0.05-0.5％抗氧化剂。同时还提供该培养基的制备方法：分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。其用于培养病毒的无血清培养基，便于病毒繁殖结束后的病毒液的纯化，降低了疫苗生产成本；此外制备方法简单、易操作。但是上述的培养基经过试验并不能使EB66细胞株达到18*10⁶cells/ml的浓度，即使如该案所述，其氨基酸浓度达到了4-10的状态，其用于培养EB66细胞株，其细胞株峰值浓度低于10*10⁶cells/ml。