[发明专利]一种生产羟基酪醇的工程菌

说明书

本发明提供了一种生产羟基酪醇的工程菌以及通过该工程菌生产羟基酪醇的方法，利用该工程菌催化酪氨酸通过双路径生产羟基酪醇，可在较高底物浓度的基础上，得到高产率和高产量的羟基酪醇。同时，本发明制备方法简单且原料易得，价格更加低廉，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生产羟基酪醇的大肠杆菌工程菌。

背景技术

羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)，化学名为3，4-二羟基苯乙醇，是在橄榄油中发现的最强大的抗氧化剂之一，比白藜芦醇具有更强的氧自由基吸收能力，表现出多种生物活性。已有研究表明其在抗肿瘤，抗血栓，调血脂和抗动脉硬化，抗病原微生物，防治视网膜黄斑变性，保护软骨和抗骨质疏松等多方面具有药理作用，在医药，保健食品，化妆品和食品添加剂等领域有着广阔的应用前景和开发潜力。

当前，羟基酪醇的合成方法主要包括植物提取，化学合成，以及生物合成。在自然资源中，HT主要以酯的形式广泛存在于橄榄植物中。从新鲜的橄榄叶、橄榄花或橄榄油厂废水中提取为当前市场上的主要生产方式，中国发明专利申请CN201610883391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取工艺；中国发明专利申请CN201710195462.7公开了一种从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。提取过程中需要使用强酸性水蒸汽，纯化过程繁琐且费用昂贵，回收率比较低，原材料的来源不稳定，且由于羟基酪醇在植物提取过程中有氧化倾向，植物提取最终获得的产物纯度只能达到20％-40％。化学合成较易获得较高纯度的羟基酪醇产品，例如，CN201110357075.1、CN201210342015.7，但目前已知的化学合成路线中涉及价格昂贵的催化剂，或者反应的步骤较多，此外，有机合成过程中涉及较多有机溶剂和金属氧化物，因此从技术和成本考虑，该方法不适用于工业化生产。因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。

目前已有部分报道使用微生物法生产羟基酪醇。中国发明专利申请CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇，由于羟基酪醇对基因的毒性，最终羟基酪醇的产量为349.05mg/L产率仅为0.017mol/mol，从头合成的羟基酪醇产量到菌株自身代谢通量和代谢调节的影响，难以实现高的生产速率和得率。2012年，Yasuharu Satoh等人报道使用一株工程大肠杆菌，使用1mM酪氨酸为底物，依次通过酪氨酸羟化酶，L-多巴脱羧酶，酪胺氧化酶，醇脱氢酶作用下生成0.19±0.0056mM羟基酪醇，产率仅为0.19mol/mol，该方法中羟基酪醇的得率较低，中间产物积累较多，且菌株对底物的消耗速率较慢(1mM酪氨酸消耗需要将近72h)。

中国发明专利申请CN201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中表达了芳香氨基转移酶(aromatic aminotransferase，ArAT)，酮酸脱羧酶(Ketoacid decarboxylase，KDC)，醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)来生产酪醇，再在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。从简单碳源出发，羟基酪醇产量能达到647±35mg/L，以6g/L(33mM)酪氨酸为底物时，羟基酪醇产量能达到1243±165mg/L(8mM)，产率仅为0.24mol/mol。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH)。另外，该方案体系中除了目标化合物羟基酪醇的积累，还有L-左旋多巴作为副产物产出，使得羟基酪醇产率较低。

现有技术已知羟基酪醇的以葡萄糖为底物从头合成受到菌株自身代谢的影响导致最终产量低(低于1g/L)，耗时长(大于48h)，产率低；以酪氨酸为底物的生物转化方法，因缺乏辅因子再生体系，以及中间产物较多，催化效率随着反应持续导致辅因子不足，难以将更多的底物进行转化，最终导致催化的效率低，产率低。目前底物浓度最高做到为6g/L(33mM)，产率仅有0.24mol/mol。基于目前各种方法的缺陷，研究一种可实现高浓度底物持续性转化，可工业化生产、同时利用廉价底物可以高效生产羟基酪醇的方法非常有必要。