[发明专利]一种表达系统及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910555315.5 | 申请日： | 2019-06-25 |
| 公开（公告）号： | CN110257375A | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 潘勤春;甘敏鑫;崔兰玉;吕军;周礼芹;蒋永强;吴健程;刘兴胥 | 申请（专利权）人： | 南宁新科健生物技术有限公司;广西医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/11 | 分类号： | C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/16;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340 | 代理人： | 牙斐颖 |
| 地址： | 530003 广西壮族自治区南宁市西乡塘区新际*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组大肠杆菌 磷脂酶C基因 制备方法和应用 表达系统 整合质粒 构建 整合 转座 大肠杆菌感受态细胞 抗生素抗性基因 构建重组质粒 生物技术领域 大肠杆菌 遗传稳定性 外源蛋白 诱导转座 重组质粒 重组菌 染色体 扩增 制备 申请 转化 | ||
1.用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
2.一种包含权利要求1所述磷脂酶C基因的载体。
3.一种包含权利要求1所述磷脂酶C基因或权利要求2载体的表达系统。
4.根据权利要求3所述表达系统，其特征在于，所述表达系统为微生物：大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述微生物，其特征在于，所述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。
6.一种制备如权利要求4-5任意一项所述微生物的方法，其特征在于，所述方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述制备微生物的方法，其特征在于，所述质粒pGRG36-T7lac-plc的制备方法为：以链霉菌DNA为模板，在磷脂酶C基因的引物对下，经PCR扩增反应获得磷脂酶C基因，再克隆到pET22b(+)上，获得重组质粒pETB2；以pETB2为模板，在ompA信号肽的引物对下，经PCR扩增获得ompA信号肽，ompA信号肽整合到pETB2上，获得重组质粒pETB2-O；pETB2-O和质粒pGRG3用于制备pETB2-O/DH5α和pGRG36/DH5α；提取pETB2-O DNA、pGRG36 DNA，通过T4 DNA连接酶将经单酶切、去磷酸化的pGRG36 DNA与经双酶切和酶切粘性末端位点填平的pETB2-O DNA连接，获得转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc。
8.根据权利要求7所述ompA信号肽的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
9.一种测试如权利要求4-5任意一项所述微生物为重组微生物的方法，其特征在于，所方法为测定微生物在不含抗生素的LB液体培养基上磷脂酶C的总酶活力为75.4U/mL～83.0U/mL。
10.如权利要求4-5任意一项所述微生物在食品工业用酶的制备上的用途。
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