[发明专利]一种表达系统及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种表达系统及其制备方法和应用，本申请扩增磷脂酶C基因、构建重组质粒pETB2‑O、构建转座整合质粒、转化大肠杆菌感受态细胞、诱导转座整合和重组菌表达的步骤，将重组质粒pETB2‑O中的磷脂酶C基因用于构建转座整合质粒，再将磷脂酶C基因整合到大肠杆菌的染色体上，从而获得重组大肠杆菌，重组大肠杆菌表达获得外源蛋白，该重组大肠杆菌不含有抗生素抗性基因，且遗传稳定性高，该方法应用于制备食品工业用酶上。

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达系统及其制备方法和应用。

【背景技术】

在食品和药品用活性蛋白质的生产中，采用基因工程技术对活性蛋白质基因进行异源表达已经被证明是提高产量和纯度的有效方法。目前，大肠杆菌作为常用的基因工程宿主菌，其生长繁殖迅速，培养简单，发酵成本较低，也没有复杂的蛋白酶系，重组蛋白较稳定，因而成为生产重组蛋白质的良好宿主。然而，大肠杆菌用于生产食品工业用酶仍存在一些缺陷，主要有：在重组大肠杆菌的高密度发酵中，表达质粒往往由于结构不稳定性和分离不稳定性而易于丢失。为了保持重组大肠杆菌表达质粒的遗传稳定性，往往需要施加选择压力，目前最常用的选择压力是添加抗生素。添加抗生素选择压力无疑会增加菌体的代谢负荷，增加生产成本，引起终产品中抗生素残留，引起抗性基因在环境中的扩散。对于食品和药物用重组蛋白质，产品中残留抗生素已逐渐被世界各国禁止。将外源基因整合到染色体上可采用同源重组和转座重组的方法，与同源重组法相比，转座重组不需要将抗生素抗性基因整合到大肠杆菌染色体，并且可以将含有抗性基因和转座酶的整合质粒驱除出宿主菌，得到遗传稳定的外源基因整合表达。

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是作用于磷脂C3位点，水解磷脂生成甘油二酯和磷酸单脂的一种水解酶，根据水解底物的特异性，细菌来源的PLC可以分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)及磷脂酰胆碱偏爱性磷脂酶C(PC-PLC)。它在抗血小板新药研究、高血压等病理研究，以及食品添加剂、油脂精炼等方面都有应用，特别是在油脂酶法脱胶的应用具有广阔的前景。由于野生微生物菌株产PLC量较低，并大多数微生物来源的PLC都以毒素因子的形式存在于致病菌，导致PLC的工业应用受到限制。

因此，有必要提供一种简单、高效、安全的利用含有完整Tn7转座元件的整合重组载体系统的方法，构建食品安全的产磷脂酶C的重组大肠杆菌整合表达系统，用于生产食品工业用酶，从而促进磷脂酶C的发酵产业化及工业应用具有重要的学术和实践价值。

【发明内容】

鉴于上述内容，本发明提供一种表达系统及其制备方法和应用，通过构建携带磷脂酶C基因的重组质粒pETB2-O，再用于构建转座整合质粒pGRG36-T7lac-plc，从而将磷脂酶C基因整合到大肠杆菌的染色体上，进而获得不含有抗生素抗性基因，且遗传稳定的重组大肠杆菌，重组菌表达获得外源蛋白，该方法应用于制备食品工业用酶，实际应用价值大。

本发明提供用于从链霉菌中扩增磷脂酶C基因的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

一种包含所述磷脂酶C基因的载体。

一种包含所述磷脂酶C基因或所述载体的表达系统。

进一步的，所述表达系统为微生物：大肠杆菌。

进一步的，所述微生物可产磷脂酶C且不具备抗性。

一种制备所述微生物的方法，所述方法为：将磷脂酶C基因与含Tn7转座酶TnsABCD的Tn7转座质粒pGRG36结合，构建插入磷脂酶C外源蛋白基因的转座整合质粒

pGRG36-T7lac-plc；通过变温培养，将磷脂酶C基因导入大肠杆菌的染色体上，得到重组大肠杆菌。