[发明专利]一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用有效
申请号: | 201910556303.4 | 申请日: | 2019-06-25 |
公开(公告)号: | CN110358746B | 公开(公告)日: | 2021-05-11 |
发明(设计)人: | 房君江;林爱兰 | 申请(专利权)人: | 上海睿康生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N9/10 | 分类号: | C12N9/10;C12Q1/48;C12Q1/28;C12Q1/26 |
代理公司: | 上海段和段律师事务所 31334 | 代理人: | 李慧;郭国中 |
地址: | 201100 上海市闵行区*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 修饰 pnp 及其 制备 核苷酸 检测 中的 应用 | ||
1.一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶,其特征在于,所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸侧链经酰化修饰;
所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法包括以下步骤:
A、将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂进行反应;
B、在步骤A所得反应物中加入尿素进行反应,使蛋白质变性;
C、步骤B后加热半胱氨酸使蛋白质复性,即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶;
步骤A中,所述嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂的质量比例为1:(3-5);
步骤A中,所述酰化试剂包括乙酸乙酯、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟中的一种或几种混合;
步骤A中,所述反应的具体步骤为:在室温下搅拌8-12小时;
步骤B中,所述反应的具体步骤为:在室温下搅拌6-8小时;所述尿素的加入量为10-100g每升步骤A所得反应物;
步骤C中,所述半胱氨酸的加入量为100-1000KU;蛋白质复性的具体步骤为:在40-55℃下静置30分钟。
2.根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶,其特征在于,步骤A中,所述反应在溶剂存在条件下进行,所述溶剂为乙二醇。
3.一种根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶在5’-核苷酸酶检测中的应用。
4.一种稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1包括以下浓度的各组分:10-100mmol/L缓冲液、1-10mmol/L 4-AA、0.1-10U/ml权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶、0.1-10U/ml过氧化物酶、0.1-10U/ml黄嘌呤氧化酶、0.1-10g/ml防腐剂、0.1-10g/L除干扰剂;
所述试剂R2包括以下浓度的各组分:10-100mmol/L缓冲液,10-100mmol/L 5’-核苷磷酸盐。
5.根据权利要求4所述的稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液中的一种或几种;
所述防腐剂为叠氮钠或proclin300。
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