[发明专利]一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用有效
| 申请号： | 201910556303.4 | 申请日： | 2019-06-25 |
| 公开（公告）号： | CN110358746B | 公开（公告）日： | 2021-05-11 |
| 发明（设计）人： | 房君江;林爱兰 | 申请（专利权）人： | 上海睿康生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/10 | 分类号： | C12N9/10;C12Q1/48;C12Q1/28;C12Q1/26 |
| 代理公司： | 上海段和段律师事务所 31334 | 代理人： | 李慧;郭国中 |
| 地址： | 201100 上海市闵行区*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 修饰 pnp 及其 制备 核苷酸 检测 中的 应用 | ||
1.一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸侧链经酰化修饰；
所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法包括以下步骤：
A、将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂进行反应；
B、在步骤A所得反应物中加入尿素进行反应，使蛋白质变性；
C、步骤B后加热半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶；
步骤A中，所述嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂的质量比例为1:(3-5)；
步骤A中，所述酰化试剂包括乙酸乙酯、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟中的一种或几种混合；
步骤A中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌8-12小时；
步骤B中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌6-8小时；所述尿素的加入量为10-100g每升步骤A所得反应物；
步骤C中，所述半胱氨酸的加入量为100-1000KU；蛋白质复性的具体步骤为：在40-55℃下静置30分钟。
2.根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，步骤A中，所述反应在溶剂存在条件下进行，所述溶剂为乙二醇。
3.一种根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶在5’-核苷酸酶检测中的应用。
4.一种稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液、1-10mmol/L 4-AA、0.1-10U/ml权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶、0.1-10U/ml过氧化物酶、0.1-10U/ml黄嘌呤氧化酶、0.1-10g/ml防腐剂、0.1-10g/L除干扰剂；
所述试剂R2包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液，10-100mmol/L 5’-核苷磷酸盐。
5.根据权利要求4所述的稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液中的一种或几种；
所述防腐剂为叠氮钠或proclin300。
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