[发明专利]一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用

说明书

本发明提供了一种修饰的PNP及其制备和在5’‑核苷酸酶检测中的应用，涉及到医学免疫体外诊断领域，所述修饰的PNP为PNP的氨基酸侧链经酰化修饰。并由其制备了稳定的5’‑核苷酸检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括缓冲液、4‑AA、修饰的嘌呤核苷磷酸氧化酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、防腐剂、除干扰剂；所述试剂R2包括缓冲液，5’‑核苷磷酸盐。本发明对5’核苷酸酶检测的酶比色法加以改进，通过对参与反应的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)进行化学修饰，使试剂抗干扰能力增强达到灵敏度高的效果。

技术领域

本发明涉及5’-核苷酸酶检测技术领域，具体涉及一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用。

背景技术

5’-NT在人体的运动、细胞生长发育、纤维蛋白合成、提高表皮或内皮屏障功能、神经传递及淋巴的再循环及黏附、免疫应答等方面均发挥重要的作用。近年来，5’-NT在很多疾病，包括肝脏等疾病的发生发展过程中的作用越来越受到人们的重视。5’-NT在人体组织中广泛存在，如肝、胆、肠、脑、心、胰等。定位于细胞质膜上，在肝内此酶主要存在于胆小管和窦状隙膜内，而5’-NT要释放入血必须要经肝胆系统内的高浓度胆汁酸去垢处理，因此患者一旦患有肝胆疾病，血清中的5’-NT水平就会出现异常。

众多研究资料表明，血清5’-NT活性升高主要见于肝胆胰系统疾病及某些恶性肿瘤，如阻塞性黄疸、肝癌、肝炎等，其活性变化与ALP一致，故有较特异的诊断价值。骨骼系统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、佝偻病、甲状旁腺功能亢进，通常ALP活性升高，而5’-NT正常。因此ALP和5’-NT同时测定有助于肝胆和骨骼系统疾病的鉴别诊断。准确的测定5’-NT显得尤为重要，测定方法也得到不断开发和改进。

诊断方法：5’-NT测定主要是酶比色法，次黄嘌呤核苷-5’-单磷酸二钠盐(5’IMP)在5’-NT催化下水解生成磷酸和次黄嘌呤核苷，同时偶联黄嘌呤氧化酶和核苷酸磷酸化酶，使次黄苷最终氧化成过氧化氢和尿酸，最后在4-AAP和3-羟基-2,4,6-三溴苯甲酸(TBHBA)的参与下经过氧化酶的催化生成红色醌亚胺，在550nm处检测吸光度的增高速率即可计算出5’-NT活性。

上述方法具有抗干扰能力强，且不受内源性和外源性磷酸干扰，适合自动化快速测定的特点，为临床常规开展5’-NT检测应用创造有利条件。目前各试剂厂家纷纷推出基于该测定原理的5’-NT试剂，但是该法测定过程中需要PO₄^3-和Mg²⁺(或Mn²⁺)生成沉淀的问题，使得测定试剂中PO₄^3-和Mg²⁺(或Mn²⁺)的浓度远远低于反应所需的最适浓度，从而造成比色反应进行的不彻底，测定时灵敏度低，重复性不佳，给临床进一步推广应用此方法带来困难。基于目前测定血清5’-NT诸多方法所存在的各种缺点，研发一种抗干扰能力强，测定灵敏度高，能真实反应血清5’–NT活性并能实现手工和全自动生化分析的匀相法测定新技术，已成为该研究领域的发展趋势。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用。本发明对5’核苷酸酶检测的酶比色法加以改进，通过对参与反应的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)进行化学修饰，提高试剂稳定性、增强抗干扰能力以及提高检测灵敏度效果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸侧链经酰化修饰。

本发明还提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，包括以下步骤：

A、将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂进行反应；

B、在步骤A所得反应物中加入尿素进行反应，使蛋白质变性；