[发明专利]一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用

说明书

本发明实施例公开了一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用，该制备方法包括如下步骤：(a)将刺激因子包被培养瓶；(b)在人外周血液中分离单个核细胞；(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中进行培养；(d)待培养3‑4天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续培养；(e)待培养7‑8天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基继续培养，待培养14‑16天后，收集单个核细胞；上述方法将单个核细胞在体外共培养2‑3周，能使NK免疫细胞扩增500‑1000倍以上，且NK免疫细胞含量达到90％以上，并能够增强NK免疫细胞的活性，使其对K562瘤细胞的体外杀伤率达90％以上。

技术领域

本发明实施例涉及免疫细胞扩增技术领域，具体涉及一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用。

背景技术

细胞治疗是继化疗、手术、放疗之后的一个新兴生物医药领域，是治疗疾病最好的方法之一。肿瘤的细胞治疗是一种全身性的免疫疗法，是把人体自身或异体的免疫细胞，进行体外培养、增殖，形成数量众多，活性超强的免疫抗癌细胞，再回输到患者体内，发挥强大的抗癌作用。与手术、放疗及化疗对免疫损伤不同，细胞治疗能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手术治疗不能触及的血液、淋巴或转移到其他组织中的癌细胞、甚至是休眠的癌细胞，相比之下治疗更加彻底。免疫活性细胞具有促进自身愈合和再生的能力，细胞治疗有长期的效果。用细胞治疗疾病，毒副作用小，安全有效。

NK免疫细胞是机体抗肿瘤、抗病毒的主要免疫活性细胞。其他几个具有抗癌功能的细胞包括杀伤性T细胞、巨噬细胞、网状内皮细胞(DC)；由于巨噬细胞内含有很多炎症因子，目前还无法用于细胞治疗；DC是一类免疫调节细胞，主要作用是抗原加工并呈递给T细胞，再靠T细胞发挥抗癌作用；所以，DC一般是用于制备治疗性疫苗；美国FDA已经批准了一个前列腺癌的DC治疗性疫苗。T细胞的抗癌作用需要再次激发才有效，只有经DC活化后才能起作用；T细胞初次遇到抗原时并无杀伤作用，而只是形成免疫记忆；只有再次遇到抗原后，才能激发出强有力的杀伤功能。现在很多人用的CIK中主要是经细胞因子活化的T细胞。其实，未经DC抗原呈递、单独靠细胞因子活化的杀伤T细胞的疗效是非常有限的。NK免疫细胞的全名叫自然杀伤细胞，其特点之一是初次遇到就有杀伤作用。NK免疫细胞还可与抗体联合使用，通过抗体介导的杀伤效应(ADCC)，一方面赋予NK免疫细胞特异性，另一方面使抗体具有更强的治疗效果；现在临床上使用的大多数抗癌单抗的治疗机理中，NK免疫细胞往往起着重要的作用。另外，T细胞和网状内皮细胞必须用自身的，因为网状内皮细胞不能呈递抗原给异体的T细胞，而异体的杀伤性T细胞会引起移植物宿主反应；但NK免疫细胞可以用同种异体的，往往正是因为这些自身细胞的免疫功能差，才发生肿瘤等疾病。再用那些功能本来就差的细胞来治疗，疗效难以太好。NK免疫细胞则不同，可以用健康人的NK免疫细胞，有望产生更好的疗效。

目前，大量制备活化的人NK免疫细胞的方法主要有两种：一是采用抗体并通过红细胞或磁性微球的分离法，直接从PBMC中分离NK免疫细胞；可以快速获得NK免疫细胞，但由于NK免疫细胞在PBMC中的比例很少，所得NK免疫细胞的数目不多，只适用于小规模制备NK免疫细胞及分析性研究；此外，正常的NK免疫细胞一般都处于抑制状态，直接使用时，即使有足够量的NK免疫细胞也很有可能没有抗癌作用。二是体外扩增法，从PBMC中扩增培养NK免疫细胞：也就是用PBMC或者已经分离的NK免疫细胞，通过一些特殊细胞因子的刺激，使NK免疫细胞在体外扩增，但是，至今大多体外扩增技术只能使NK免疫细胞扩增几十倍，且纯度低、活性差、成本高。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，以解决现有技术中NK免疫细胞扩增中存在的NK免疫细胞数量少、抗癌作用差、扩增倍数少、纯度低、活性差以及成本高的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：