[发明专利]使用校正因子的显微成像方法

说明书

本发明涉及显微成像方法，其包含以下步骤：用照明辐射照明样品(1)并沿着检测轴线捕获检测辐射，所述检测辐射已经由照明辐射引起，在第一次时作为宽场信号(WF)且在第二次时作为复合信号(CI)，所述复合信号已经由共焦图像和宽场图像的叠加来形成；通过从复合信号(CI)减去宽场信号(WF)来提取共焦图像，其中使用校正因子。所述方法的特征在于，为每个执行的成像和/或为每个成像的样品(1)确定当前校正因子，并且使用相应的当前校正因子来提取共焦图像。

技术领域

本发明涉及根据独立权利要求的前序部分的显微成像方法。

背景技术

在显微术的技术领域中(例如在生物/技术样品或样品区域的高分辨率三维表示中)，现有的问题在于用照明辐射的最低可能的强度照射样品，而同时具有可用于高分辨率检测和成像的高强度的检测辐射。同时，提供图像数据并随后成像应该在最短可能的时间内实现，理想地实时地来实现。

DE 10 2014 004 249 A1已经公开了相关的旋转盘显微术的方法。在通过其中公开的相关的旋转盘显微术来确定样品的形貌的方法中，执行以下步骤：在交替捕获放置在物体台上的样品的第一图像和第二图像期间，存在物体台和/或聚焦驱动器的垂直移动。在该过程中，垂直聚焦位置被储存为每个图像的元数据。在其他步骤中插值两个第一图像和两个第二图像，并且获得中间图像或中介图像。出于为某一垂直位置产生共焦图像的目的，中介图像通过计算与所述位置处的第二图像或第一图像组合。

从WO 97/31282 A1已知，出于产生复合图像和非共焦图像的目的，在照明和/或检测束路径中使用适当的掩模。通过从这两个图像类型计算，由适当的组合来提取共焦图像。这允许非常快速的成像。同时，使用高比例的检测光，所以用低强度的照明辐射照明样品是足够的。

Neil等人(Neil，M.A.A等人，(1997)，A light efficient optically sectioningmicroscope；Journal of Microscopy 189：114-117)和Wilson等人(Wilson，T.等人，(1996)，Confocal microscopy by aperture correlation；OPTICS LETTERS 21：1879-1881)的出版物同样提出了这样的可能性：通过其可以从复合图像和宽场图像中提取共焦信号。

当计算共焦图像时，可以使用以下公式：

共焦信号＝(复合信号)-n×(宽场信号)。

在此，因子n是为成像系统确定一次并在没有改变的情况下应用的校正因子，并且因子n独立于样品。校正因子用于补偿系统相关的偏差，例如复合信号和宽场信号的光路径的不同传输值。使用该进程，例如可以沿着下文还称为z轴的检测轴线来捕获图像的堆栈(z-堆栈)，并且可以出于三维成像的目的(例如样品的形貌)组合这些图像。

发明内容

本发明基于以下目的，提出三维成像的改进选项，特别是使用低照明强度。

该目的通过下文所述的显微成像方法来实现。在下文中发现有利的发展例。

显微成像方法包含以下步骤：用照明辐射照明样品并沿着检测轴线捕获检测辐射，所述检测辐射已经由照明辐射引起。在第一次时，检测辐射被捕获作为宽场信号，在第二次时，检测辐射被捕获作为复合信号，所述复合信号由共焦图像或其信号以及宽场信号的叠加来形成。共焦图像通过从复合图像减去宽场图像，并使用校正因子来获得。在此，从复合信号中减去宽场图像信号，并考虑校正因子。

该方法的特征在于，为每个执行的成像和/或为每个成像的样品来确定当前校正因子。使用相应的当前校正因子来提取相应的共焦图像。

令人意外地，发现为最初设想的应用设定一次成像系统的校正因子是完全足够的；然而，根据本发明的方法不仅减少成像像差而且允许检查新类别的材料。