[发明专利]沙门菌fimW基因新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒

说明书

本发明公开了一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒。本发明通过优化反应条件，发明了一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒，并对其特异性和敏感性进行了测试，意料之外地发现其具有很强的特异性，最低可检出菌液浓度为7.3×10¹CFU/ml，检测灵敏度比PCR方法高1000倍，同时简化了检验流程，预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，检测结果无需开盖。阳性为黄色，阴性为红色，颜色对比明显，直观易判别。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体地说，涉及一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒。

背景技术

沙门菌(salmonella)作为临床常见的食源性人兽共患病原菌，是一种无荚膜的革兰氏阴性直杆菌。目前沙门菌已报道至少2500个血清型，国内报道有300多种，不同血清型沙门氏菌的侵袭力与致病力显著不同，其所引起的疾病都是和宿主相互对应的。感染沙门菌可见发热、败血、恶心、食欲不振、下痢等症状。除了能够通过污染食物引起人类食物中毒感染外，沙门菌感染在畜禽生产中也很常见，在猪生产中造成仔猪副伤寒、在家禽生产中可引发鸡白痢、鸡伤寒，鸡副伤寒等疾病，往往对生产生活造成很大损失。

沙门菌菌毛类型众多，主要有Ⅰ型～Ⅳ型等，Ⅰ型菌毛蛋白由fimA、fimI、fimC、fimD、fimH、fimF、fimZ、fimY和fimW 9个基因编码，其中主要菌毛亚单位蛋白fimA的调控基因主要有fimZ、fimY和fimW。众多菌毛类型中只有Ⅰ型菌毛广泛分布在各血清型的沙门菌中，其他型菌毛分布的血清型均有限。将fimW序列在Gen-Bank上进行比对，结果显示含有fimW基因的都为沙门菌，而且在其它肠道杆菌的基因组中未发现与fimW同源的序列，说明fimW基因是沙门菌特有的基因。

目前，对沙门氏菌的检测主要是以传统的细菌分离和生化鉴定等方法为主，存在操作繁琐、灵敏度低和准确率不高等缺陷，不能满足及时有效的质量监测和疾病控制需求。随着分子生物学技术的发展，新的诊断技术如酶联免疫、免疫荧光、PCR、荧光定量PCR等检测病原核酸和蛋白质等生物大分子的方法已经广泛应用到沙门氏菌的检测中。然而，这些技术在应用过程中或需要熟练的操作人员，或需要昂贵的仪器设备，不适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。

环介导等温扩增(LAMP)技术作为一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点。其原理是针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNAploymerase)，在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。由于其对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果通过肉眼观察即可判断，简便快捷，适合基层快速诊断，近年来已被广泛应用于病原体检测。

目前LAMP的结果判别方法包括电泳、添加SYBR GreenⅠ荧光染料或金属离子指示剂进行可视化判别，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等。然而，这些试剂或需开盖添加、或色差变化较小不易分辨。研究表明，当DNA聚合酶将一个脱氧核苷酸分子结合到新的DNA双链上时，会产生一个氢离子作为副产物，氢离子浓度的增加造成反应体系PH值的降低，基于此，本发明采用了甲酚红作为PH指示剂用于结果的判定，反应结果色差易分辨(黄色为阳性，红色为阴性)，无需开盖。其特异性强，敏感性比常规PCR方法高1000倍。临床检测表明，该试剂盒符合率高，取预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，不会发生漏检。

如中国专利CN201711409788.1公开了一种快速检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用。该引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组、反应试剂；该试剂盒的使用方法如下：首先配制扩增反应体系；恒温反应所得产物直接进行肉眼判读：阳性结果为黄色，阴性结果为红色，该试剂盒操作简单、成本低廉，结果易于观察，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，但该发明仅针对猪圆环病毒3型。