[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：

步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；

步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20-40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；

步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片，再将每片脐带组织薄片对半剪成两片；

步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；

步骤五，脐带组织薄片培养；将清洗干净后的脐带组织薄片均匀地贴在细胞培养皿上，并在脐带组织薄片的上面盖上玻璃片；然后，加入完全培养液，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养；隔4天更换一次完全培养液，并观察培养皿底和玻璃片上脐组织带薄片周围的细胞生长的情况；

步骤六，消化处理；当脐带组织薄片周围的培养皿底部和玻璃片上长满大量细胞后，去除脐带组织薄片，用胰蛋白酶溶液对培养皿和玻璃片上的细胞进行消化；消化1—3分钟；

步骤七，离心收集细胞；加入2ml胎牛血清终止消化，收集消化液于50ml离心管中，离心收集细胞；

步骤八，重悬接种培养；将离心收集到的细胞用所述完全培养液重悬接种于培养瓶中培养；培养得到的细胞为P1代细胞；

步骤九，消化传代培养；待P1细胞长至80%—95%融合后以，用胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代培养得到的细胞为P2代细胞；其传代培养的方式是以一瓶传5瓶的比例进行传代；

步骤十，细胞鉴定；待P2代细胞长至80%—95%融合后，消化收集细胞进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤一中所述的脐带组织保护液的成分为DMEM/F12培养基、D-Hanks液、链霉素、青霉素，DMEM/F12培养基和D-Hanks液的体积比为1：1，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100g/ml。

3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤四中所述的生理盐水是质量浓度为0.9%的注射用生理盐水。

4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤五中所述的完全培养液为含有5%—15%体积浓度胎牛血清的DMEM/F12培养基。

5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤六中所述的胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.125%—0.5%。

6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤七中所述的离心收集细胞，其离心力为300-700G。