[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：采集脐带标本；清洗脐带标本；脐带标本切片；脐带组织薄片处理；脐带组织薄片培养；消化处理；离心收集细胞；重悬接种培养；消化传代培养；细胞鉴定。本发明能够高效的分离脐带间充质干细胞，组织长出细胞的概率高，能够满足临床应用和大批量生产干细胞制品的需要；分离培养工作量小、效率高。

技术领域

本发明涉及干细胞分离培养，尤其涉及一种脐带间充质干细胞分离培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一种成体干细胞，它存在于脐带、骨髓、脂肪和脐带血等一些组织中，具有很强的自我更新及多胚层分化能力。研究表明它在免疫调节和促进组织修复方面疗效显著，已经大量用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、移植物抗宿主病、肝纤维化等多种重大疾病的临床研究和治疗上。

脐带间充质干细胞是从足月分娩断脐后的新生儿脐带中提取，具有来源丰富、不伤及身体、增殖能力强、具有多胚层分化能力、免疫原性低等优点，已经得到了越来越多专业人士的认可和应用。

目前国内外常用的分离方法大致有两种：

一是酶解法；酶解法成本高，对细胞有损伤，得到的原代细胞数量少，想要扩增到临床应用的细胞数量，就得在体外进行更多代数的培养，增加了细胞突变的几率，增大了临床应用的风险。

二是组织块贴壁培养法；常规的组织块贴壁培养法是将脐带组织剪碎，然后将细小的组织块一颗一颗的铺到培养皿底部，每个培养皿需要铺几百块组织，虽然可以避免酶解法的一些弊端，但是工作量大，组织长出细胞的概率低。分离少量的细胞用于科研可以，但是要达到临床应用的细胞数或者大批量生产干细胞制品的话，常规的组织块贴壁培养法就不适合了。

CN 103589683A公开了“一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法”。该分离方法包括：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO₂培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。上述培养方法包括：对培养皿进行包被处理，弃去明胶，用PBS缓冲液进行洗涤；将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于培养皿中；待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。毫无疑问，这是所属技术领域的一种有益的探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞分离培养方法，其能够高效的分离脐带间充质干细胞，组织长出细胞的概率高，能够满足临床应用和大批量生产干细胞制品的需要；分离培养工作量小、效率高。

本发明所述的一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：

步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；

步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20-40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；

步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片，再将每片脐带组织薄片（沿脐带标本的纵向）对半剪成两片；

步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；