[发明专利]一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法

权利要求书

1.一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，利用C57BL/6J小鼠血清中异柠檬酸脱氢酶2对低剂量伽马射线辐照非常敏感的特性，根据小鼠接受的低剂量伽马射线辐照剂量与血清中IDH2的相对表达量的下调率的剂量-效应关系，小鼠血清中异柠檬酸脱氢酶2的相对表达量的下调率，评估低剂量伽马射线辐照的生物损伤，其特征在于，具体步骤包括：

（1）建立低剂量辐照小鼠模型；

（2）采集血清；

（3）异柠檬酸脱氢酶2相对表达量下调率的检测；

（4）辐照损伤综合评价；

所述建立低剂量辐照小鼠模型具体为：

选取6周到7周的雄性小鼠，分组，对照组小鼠放在无伽马射线辐照的环境中饲养，实验组小鼠分别放在剂量率为12.5、25.0和50.0 μGy/h的伽马射线辐照环境中饲养，总辐照时间为90 d，每天辐照8 h；

所述的采集血清具体方法为：

采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4^oC冰箱静置过夜，隔天3000 r/min离心20 min分离血清；

所述的异柠檬酸脱氢酶2的相对表达量下调率的检测具体方法为：

将收集的接受过低剂量伽马射线辐照的小鼠血清进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行异柠檬酸脱氢酶2的相对表达量下调率分析。

2.根据权利要求1所述的一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，其特征在于，所述蛋白提取具体步骤如下：

淀样本中的蛋白，去上清，晾干，-80℃保存，干燥后的蛋白质团块中加入200-250 μLL3裂解液，反复吹打直至蛋白质分散，超声助溶，4℃，12000 r/min，离心20 min，吸出上清液，转移至EP管中。

3.根据权利要求1所述的一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，其特征在于，

所述总蛋白浓度测定的具体步骤如下：

将0.2 mg/ml 的BSA 标准品溶液加稀释液，依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml 的标准品溶液，然后测定它们在562 nm下的吸光度值，绘制标准曲线，然后测定每个样品溶液在562 nm下的吸光度值后，再通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度。

4.根据权利要求1所述的一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，其特征在于，

所述蛋白质变性的具体步骤如下：

将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液，沸水浴变性15 min，放入-20℃冰箱保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，其特征在于，

所述凝胶电泳的具体步骤如下：

将30％丙烯酰胺、1.5 M TRIS－HCl、10％SDS、AP和TEMED配制成10%的分离胶和5%的浓缩胶；待分离胶凝固后，在电泳槽中加入电泳液，将变性后的蛋白质样品加入电泳孔中，进行电泳，将浓缩胶电压调至75 V，分离胶电压调至120 V，电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部，即终止电泳，进行转膜。

6.根据权利要求1所述的一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法，其特征在于，

所述转膜的具体步骤如下：

先采用甲醇将PVDF膜进行活化，再在膜的底部放置5-6张7×9 cm的滤纸，再一同放置于转膜仪中，加入转膜液，300 mA恒流转膜半小时，转膜过程中，将转膜槽放置于冰水中降温。