[发明专利]一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒及应用

权利要求书

1.一种酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒，其特征在于所述重组质粒是将卡那霉素抗性基因KanR、cer基因与酪氨酸酚裂解酶基因共同导入载体获得的；所述卡那霉素抗性基因KanR核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述cer基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒，其特征在于所述载体为组成型表达质粒pET-3a。

3.如权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒，其特征在于所述酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

4.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒的构建方法，其特征在于所述方法为：将酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL与线性化质粒pET-3a连接，获得质粒pET-3a-Fn-TPL；再将卡那霉素抗性基因KanR与线性化质粒pET-3a-Fn-TPL连接，获得质粒pET-3a-KanR-Fn-TPL；最后将cer基因与线性化质粒pET-3a-KanR-Fn-TPL连接，获得重组质粒pET-3a-KanR-cer-Fn-TPL。

5.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒构建的基因工程菌。

6.如权利要求5所述工程菌，其特征在于所述工程菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主构建而成。

7.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒在提高酪氨酸酚裂解酶产量中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用方法为：

(1)将酪氨酸酚裂解酶基因重组质粒构建的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养15h，获得活化菌体；

(2)挑平板上单菌落接种于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养8h，作为种子液；

(3)按体积浓度2％的接种量将50mL种子液接种到装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，搅拌转速300rpm，通气量5m³/h，pH控制为5.5，在0～10h内37℃培养，10h后32℃培养，当溶氧大于5％时，控制溶氧为4-6％，通过DO-STAT的补料方法进行发酵培养，获得含酪氨酸酚裂解酶的发酵液；所述发酵培养基组成：甘油2.3g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾0.186g/L，硫酸镁1.026g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾10.2g/L，磷酸吡哆醛7.5mg/L，微量元素1.5mL/L，溶剂为水；所述微量元素组成为：FeSO₄·7H₂O 2.8g/L，MnCl₂·4H₂O 2g/L，CoSO₄·7H₂O 2.8g/L，CaCl₂·2H₂O 1.5g/L，CuCl₂·2H₂O 0.2g/L，ZnSO₄·7H₂O0.3g/L，溶于1mol/L HCl中；所述补料培养基组成为：甘油110g/L，其余成分为发酵培养基浓缩两倍。